(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611168793.3
(22)申请日 2016.12.16
(71)申请人 天津科技大学
地址 300222 天津市河西区大沽南路1038
号天津科技大学
(72)发明人 杜欣军 徐艺芮 李萍 王硕
(74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限
公司 12209
代理人 赵瑶瑶
(51)Int.Cl.
C12M 1/34(2006.01)
C12Q 1/06(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种菌落总数测试片及其制作
方法，该装置包括了由无纺布和滤膜组合而成的
置可容纳500μl的液体。通过本发明所述方法制
作的测试片，在接种液体样品后在37℃条件下培
养48h可对红菌落进行计数。通过对测试片法
和国标法的对比实验结果可知，测试片对实验菌
种检测符合度能够达到105％，测试片对实际样
品菌落总数检测符合度能够达到89％以上。使用
该测试片进行菌落计数操作简便、菌落形态良
好、
结果准确。权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 106520542 A 2017.03.22
C N 106520542
A
1.一种菌落总数测试片，其特征在于：包括透明塑料上层膜、圆环形垫圈、滤膜、厚无纺布、薄无纺布、环形垫圈、底板，具体结构如下：在底板和上层膜之间同轴固装两个环形垫圈，在两个环形垫圈之间夹装滤膜，在下层环形垫圈的圆环内上下同轴嵌装两层无纺布，上层为厚无纺布、下层为薄无纺布，
2.根据权利要求1所述的菌落总数测试片，其特征在于：所述无纺布上还吸附有冷水可溶胶菌落总数显培养基。
3.根据权利要求1所述的菌落总数测试片，其特征在于：所述菌落总数显检测培养基的组分为：葡萄糖1.25g/L、吐温-80 0.025g/L、胰蛋白胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％的TTC显剂。
4.根据权利要求1所述的菌落总数测试片，其特征在于：所述冷水可溶胶菌落总数显培养基组分为：葡萄糖1.25/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％％的TTC显剂和终浓度1.6％的冷水可溶胶凝剂。
5.根据权利要求1所述的菌落总数测试片，其特征在于：所述可溶胶凝剂为黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、卡拉胶，或者是人工合成的胶凝剂如羟丙基纤维素、丙烯酸酯结构胶。
6.根据权利要求1所述的菌落总数测试片，其特征在于：所述透明塑料上层膜为防水透气PET塑料薄膜，厚度为0.6mm，滤膜为尼龙膜、混合纤维素膜、聚醚砜膜或聚四氟乙烯膜滤膜，直径为4cm-7cm的圆形。
7.一种制备菌落总数测试片的方法，其特征在于：步骤如下
⑴培养基的制备
⑵载体结构的制备
将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min，使无纺布浸满培养基。微孔滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基；
由下至上依次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的薄层无纺布、厚层无纺布和不含胶凝剂的培养基，叠放完成后置于55℃烘箱干燥，烘干后的上述3层复合片层粘合在一起且在后续制作和接种时不会移动、脱离，通过上述方法制得的即为载体结构；
⑶测试片的制备
将3mm厚的垫圈作为下层，上述操作所制得的载体结构作为中层，4.5mm 厚度的垫圈作为上层，组合制得三层“夹心”结构，即为测试片主体结构；
将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上，覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材；⑷包装和灭菌。
权 利 要 求 书1/1页CN 106520542 A
一种菌落总数测试片及其制作方法
技术领域
[0001]本发明属于食品检测技术领域，具体设计一种菌落总数测试片、制备方法及其在检测食品中菌落总数方面的应用。
技术背景
[0002]食品中菌落总数时食品卫生检测中的一项重要指标，是判定食品被细菌污染程度的标记。微生物检测的经典方法——平皿倾注法有良好的准确度，但操作繁琐，对计数人员有一定的专业要求。微生物检测测试片应运而生，应用无纺布、滤膜或冷水可溶胶作为培养基的载体，直接滴加样品液就能有针对性地对目标菌种进行筛选、培养、计数。最大优点是省却了繁重的准备工作，直接接种测试片，适宜温度培养后计数，使用后经灭菌便可弃置，简单方便，缩短检测时间且携带方便，适合户外操作。
[0003]20世纪80年代起，国内外有许多相关产品问世，如德国R-BIOFHARM公司的RIDA COUNT和日本CHISSO公司的SANTTA-KUN微生物快速检测片，是以无纺布为载体的新型检测片；3M公司以冷水可溶凝胶和多孔膜为载体的测试片。其中，3M公司技术最为先进和成熟。但一般食品企业无法承受进口检测产品的高额开销。
[0004]国内几家微生物公司近年来也陆续推出了相关测试片，例如以纸片为载体的绿洲牌微生物测试片；
以无纺布为载体的北京良润生物牌测试片。虽然这些测试片便于携带且操作方便。但仍存在一些不足，特别是在细菌生长符合度方面有待提高。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种符合度高且价格低廉的菌落总数测试片，该测试片依次由厚度为0.6mm的透明塑料上层膜、有粘性的厚度4.5mm圆环形垫圈层1、直径6cm滤膜、直径5.2cm无纺布、有粘性的厚度3mm的环形垫圈2、有粘性的边长10.5cm的正方形底板组成；无纺布和滤膜上吸附有菌落总数显培养基，无纺布上还吸附有冷水可溶胶。本发明可以检测500μl的液体样品。
[0006]本发明实现目的的技术方案如下：
[0007]一种菌落总数测试片，包括透明塑料上层膜、圆环形垫圈、滤膜、厚无纺布、薄无纺布、环形垫圈、底板，具体结构如下：在底板和上层膜之间同轴固装两个环形垫圈，在两个环形垫圈之间夹装滤膜，在下层环形垫圈的圆环内上下同轴嵌装两层无纺布，上层为厚无纺布、下层为薄无纺布，两层无纺布和滤膜上均吸附有菌落总数显培养基。
[0008]而且，所述无纺布上还吸附有冷水可溶胶菌落总数显培养基。
[0009]而且，所述菌落总数显检测培养基的组分为：葡萄糖1.25g/L、吐温-800.025g/ L、胰蛋白胨6.2
5/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％的TTC显剂；
[0010]而且，所述冷水可溶胶菌落总数显培养基组分为：葡萄糖1.25/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％％的TTC显剂和终浓度1.6％的冷水可溶胶凝剂。
[0011]而且，所述可溶胶凝剂为黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、卡拉胶，或者是人工合成的胶凝剂如羟丙基纤维素、丙烯酸酯结构胶。
[0012]而且，所述透明塑料上层膜为防水透气PET塑料薄膜，厚度为0.6mm，滤膜为尼龙膜、混合纤维素膜、聚醚砜膜或聚四氟乙烯膜滤膜，直径为4cm-7cm的圆形。
[0013]一种制备菌落总数测试片的方法，步骤如下
[0014]⑴培养基的制备
[0015]⑵载体结构的制备
[0016]将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min，使无纺布浸满培养基。
[0017]微孔滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基；
[0018]由下至上依次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的薄层无纺布、厚层无纺布和不含胶凝剂的培养基，叠放完成后置于55℃烘箱干燥，烘干后的上述3层复合片层粘合在一起且在后续制作和接种时不会移动、脱离，通过上述方法制得的即为载体结构；
[0019]⑶测试片的制备
[0020]将3mm厚的垫圈作为下层，上述操作所制得的载体结构作为中层，4.5mm厚度的垫圈作为上层，组合制得三层“夹心”结构，即为测试片主体结构；
[0021]将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上，覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材；
[0022]⑷包装和灭菌。
[0023]本发明与其他技术相比具有以下优势：
[0024]本发明研制的是基于滤膜和无纺布为载体的菌落总数测试片，与同类产品相比，突出的优点在于该测试片菌落总数培养基由基础培养基、显剂和表面活性剂组成；载体由滤膜和无纺布组成；上层垫圈与滤膜构成的空间正好能容纳500μl的液体样品。加入待检食品样品稀释液于滤膜中央后，盖住上层覆膜，这时样品均匀扩散于垫圈形成的样品槽内，溶液向下渗透，被无纺布和吸附于无纺布的冷水可溶胶吸收，样品中的细菌被截留于滤膜上，同时无纺布吸收的培养基向上渗透，以提供细菌的生长，表面
活性剂有助于待测样品中菌落的均匀分布与可视计数，显剂的加入有利于菌落的辨认和统计。
[0025]通过本专利所述方法制作的测试片，在接种液体样品后在37℃条件下培养48h可对红菌落进行计数。通过对测试片法和国标法的对比实验结果可知，测试片对实验菌种检测符合度能够达到105％，测试片对实际样品菌落总数检测符合度能够达到89％以上。使用该测试片进行菌落计数操作简便、菌落形态良好、结果准确。
附图说明
[0026]图1为菌落总数测试片结构示意图，其中各部分为：透明塑料上层膜1、环形垫圈2、滤膜3、厚无纺布4、薄无纺布5、环形垫圈6、底板7。
[0027]图2为菌落总数检测结果图。
[0028]具体的实施方式
[0029]为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0030]一、测试片结构的主要优化过程
[0031]⑴不同载体结构可行性
[0032]通过参考相关文献，结合收集的原始材料进行载体结构初筛，包括对滤纸、无纺布、无纺布滤纸二者结合、滤纸结合滤膜、无纺布结合滤膜、无纺布结合滤纸和滤膜等多种结构可行性评估。初筛后，选择了四类可能作为载体的结构进行复筛。第一类是纯无纺布结构，第二类是纯滤纸结构，第三类是上层滤膜加下层无纺布结构，第四类是以上层滤膜加下层滤纸结构，第五类是上层滤纸下层滤膜结构。
[0033]实验结果表明，第三类结构和第四类结构效果明显优于其余几类结构，这两类结构共同点均以滤膜为载体上层结构，而下层为吸水层结构。结合滤纸、无纺布规格，对载体吸水材料进行最终筛选，最终确定25g/m2和45g/m2，直径5.2cm的圆形无纺布作为载体吸水层。
[0034]⑵滤膜种类选择
[0035]用国产某牌0.22μm混合纤维素、0.45μm混合纤维素、0.22μm尼龙、0.45μm尼龙滤膜作为覆膜层制作测试片，发现菌落在0.45μm尼龙滤膜表面生长正常，菌落颜鲜艳，液体样品能在较短时间内被载体吸收。
[0036]⑶胶体浓度优化
[0037]基础培养基中胶体浓度越高，吸水性能越强。当吸水性能较弱时，会出现菌落形状不佳的状态，
出现晕染情况；当吸水性能过强时，会出现滤膜层失水过多干燥，菌落无法生长的情况。所以选用不同瓜尔豆胶浓度的培养基做对比实验，发现1.6％胶体浓度制作的测试片符合度明显优于其余浓度胶体制得的测试片。
[0038]⑷垫圈层数优化
[0039]为了避免液体样品的溢出和加入液体样品后滤膜凸起的情况，设计了上下层垫圈结构。用1.5mm、3mm、4.5mm三种厚度的垫圈进行组合，结合点圈层对测试片整体结构的影响和测试片对比国标的符合度进行垫圈组合选择，最终确定上层垫圈4.5mm、下层垫圈3mm厚的组合为最优组合。
[0040]二、菌落总数测试片的结构
[0041]一种菌落总数测试片，包括透明塑料上层膜1、有粘性的圆环形垫圈层2、滤膜3、厚无纺布4、薄无纺布5、有粘性的环形垫圈2、有粘性的底板7，具体结构如下：在底板和上层膜之间同轴固装两个环形垫圈2、6，在两个环形垫圈之间夹装滤膜，在下层环形垫圈的圆环内上下同轴嵌装两层无纺布，上层为厚无纺布4、下层为薄无纺布5。
[0042]两层无纺布和滤膜上均吸附有菌落总数显培养基，无纺布上还吸附有冷水可溶胶；
[0043]本发明中菌落总数显检测培养基的组分为：葡萄糖1.25g/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨6.25/L
、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％的TTC显剂；
[0044]含有胶凝剂的菌落总数显培养基组分为：葡萄糖1.25/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％％的TTC显剂和终浓度1.6％的冷水可溶胶凝剂。
[0045]其中，胶凝剂可以是天然的胶凝剂如黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、卡拉胶，或者是人工合成的胶凝剂如羟丙基纤维素、丙烯酸酯结构胶等。优选的，是瓜尔豆胶。
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