(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010619783.7
(22)申请日 2020.06.30
(71)申请人 段娟丽
地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西
路169号西京医院
(72)发明人 王琳 段娟丽 阮柏 韩骅
(74)专利代理机构 苏州中合知识产权代理事务
所(普通合伙) 32266
代理人 刘召民
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种小鼠肝实质细胞及非实
质细胞的一步分离方法，本发明经门静脉给麻醉
小鼠在体灌注IV型胶原酶消化液后，剪下肝组
织，置于GentleMACS C管中，放在组织匀浆器上
匀浆，并在37℃恒温箱消化15‑20分钟后过细胞
筛网获得细胞悬液。通过50g低速离心可获得肝
实质细胞。再利用OptiPrep TM 密度梯度离心获得
肝星状细胞，随后结合免疫磁珠分选技术利用小
鼠CD146(LSEC)免疫磁珠阳性分选获得肝血窦内
皮细胞。此方法经一步分离即可获得可获得高纯
度、
高活性的肝实质细胞及非实质细胞。权利要求书2页 说明书4页 附图1页CN 111876372 A 2020.11.03
C N 111876372
A
1.一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，包括：
1)经门静脉给麻醉小鼠在体灌注胶原酶消化液；
2)灌注结束后，剪下肝叶，剔除胆囊，将肝叶置于组织分离管中，匀浆，37℃恒温消化15-20min后，终止消化，过细胞筛网，收集细胞悬液；
3)将步骤2)收集的细胞悬液50g离心3-5min，所得上清液为肝非实质细胞悬液，细胞沉淀为肝实质细胞沉淀；
4)将步骤3)所得细胞沉淀用10％DMEM洗两次，所得细胞即为肝实质细胞；将步骤3)所得上清液，利用密度梯度离心获得肝星状细胞HSC，随后利用小鼠CD146免疫磁珠阳性分选获得肝血窦内皮细胞LSEC。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，步骤1)中还包括，通过以下方法麻醉小鼠：8-12周龄C57/6g小鼠实验前禁食12h，用1％钠腹腔注射麻醉小鼠，75％酒精消毒小鼠全身，固定小鼠，开腹，暴露出下腔静脉和门静脉。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，步骤1)中所述胶原酶消化液为IV型胶原酶消化液。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，步骤1)中，采用37℃预热的solutionⅠ和solutionⅡ各20ml在体灌注小鼠，其中，solutionⅠ：KRB+EDTA；
solutionⅡ：KRB+Ca/Mg+胶原酶Ⅳ，使用前现加0.5mg/ml胶原酶Ⅳ；
KRB：NaCl 9g+KCl 0.416g+NaHCO3 2.1g+Glu 1.08g+Hepes 4.8g溶于1L纯水。
5.根据权利要求4所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，灌注solutionⅡ时间歇性用镊子夹住下腔静脉，使得从门静脉注入的solutionⅡ充分消化肝组织。
6.根据权利要求1所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，步骤2)中，所述组织分离管为GentleMACS C管，C管中提前加入solutionⅡ和DNaseⅠ；加入磁珠buffer 5ml终止消化，组织匀浆液中加入1ⅹHBSS缓冲液过100μm细胞筛网。
7.根据权利要求1所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，步骤4)中，利用OptiPrep TM密度梯度离心获得肝星状细胞HSC。
8.根据权利要求7所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，通过以下步骤获得肝星状细胞HSC：
4-1)将步骤3)所得上清液50g离心3min，收集非实质细胞悬液，400g离心6min，收集细胞沉淀；
4-2)将步骤4-1)所得细胞沉淀用17.6％iodixanol重悬，充分混匀后缓慢加到15ml离心管中，再轻柔加入10％iodixanol，最后在液面最上层加入4ml DMEM，1400g离心21min，不带刹车；
4-2-1)收集10％iodixanol上层细胞，加入等体积的DMEM，吹打混匀，400g离心6min，弃上清，所得细胞沉淀为小鼠星状细胞HSC。
9.根据权利要求8所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，通过以下步骤获得肝血窦内皮细胞LSEC：
4-2-2)收集17.6％与10％iodixanol之间的细胞层，在收集到的细胞悬液中加入等体积的DMEM，吹打混匀，400g离心6min，弃上清，用磁珠buffer洗细胞一次；
4-2-3)用磁珠buffer 90μl重悬细胞沉淀，加入10μl anti-LSECmicrobeads，4℃，避光孵育15min；磁珠buffer1ml洗细胞，350g离心5min，弃上清；
4-2-4)磁珠buffer 500μl重悬细胞，细胞悬液转移到MS Columns，细胞悬液滴完后，再用1ml磁珠Buffer洗MS columns；
4-2-5)在MS Columns中加入适量磁珠Buffer，取下MS Columns，转移到15ml离心管中；
4-2-6)将得到的细胞悬液350g离心5min，弃上清，加PBS洗细胞两次，即得到小鼠肝血窦内皮细胞LSEC。
10.根据权利要求7所述的一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，其特征在于，17.6％iodixanol：1.76ml OptiPrep WS-40％+2.24ml DMEM；10％iodixanol：1ml OptiPrep WS-40％+3ml DMEM；OptiPrep WS-40％：2ml OptiPrep TM分离液+1ml DMEM；DMEM 无血清。
一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞分离技术领域，涉及一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法。
背景技术
[0002]肝脏是人体代谢的中心，在许多功能执行中发挥着重要作用。肝脏是个异质性器官，由多种不同的细胞构成，其中，肝实质细胞(hepatocyte，HC)约占细胞总数60％-70％、肝脏总体积的80％，肝非实质细胞约占肝细胞总数的30％-40％，肝非实质细胞中，肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)约占50％、枯否细胞(kupffer cell，KC)约占20％、淋巴细胞约占25％、星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)约占5％。肝脏是人体内复杂程度仅次于大脑的器官，其复杂功能的发挥依赖于组成肝脏的各种类型细胞。人们对肝脏多种特异功能的理解首先是通过生物化学研究得到，过去30年建立的分离肝细胞方法进一步扩展了对这种功能的理解，如分离HC的方法。分离和培养非实质细胞方法的出现使对非实质细胞细致结构和功能特征的研究成为可能。
发明内容
[0003]本发明的旨在提供一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法。[0004]为了实现上述目的，
本发明采用以下技术方案：
[0005]一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法，包括：
[0006]1)经门静脉给麻醉小鼠在体灌注胶原酶消化液；
[0007]2)灌注结束后，剪下肝叶，剔除胆囊，将肝叶置于组织分离管中，匀浆，37℃恒温消化15-20min后，终止消化，过细胞筛网，收集细胞悬液；
[0008]3)将步骤2)收集的细胞悬液50g离心3-5min，所得上清液为肝非实质细胞悬液，细胞沉淀为肝实质细胞沉淀；
[0009]4)将步骤3)所得细胞沉淀用10％DMEM洗两次，所得细胞即为肝实质细胞；将步骤3)所得上清液，利用密度梯度离心获得肝星状细胞HSC，随后利用小鼠CD146免疫磁珠阳性分选获得肝血窦内皮细胞LSEC。
[0010]优选地，步骤1)中还包括，通过以下方法麻醉小鼠：8-12周龄C57/6g小鼠实验前禁食12h，用1％钠腹腔注射麻醉小鼠，75％酒精消毒小鼠全身，固定小鼠，开腹，暴露出下腔静脉和门静脉。
[0011]优选地，步骤1)中所述胶原酶消化液为IV型胶原酶消化液。
[0012]优选地，步骤1)中，采用37℃预热的solutionⅠ和solutionⅡ各20ml在体灌注小鼠，其中，
[0013]solutionⅠ：KRB+EDTA；
[0014]solutionⅡ：KRB+Ca/Mg+胶原酶Ⅳ，使用前现加0.5mg/ml胶原酶Ⅳ；
[0015]KRB：NaCl 9g+KCl 0.416g+NaHCO3 2.1g+Glu 1.08g+Hepes 4.8g溶于1L纯水。
[0016]更优选地，灌注solutionⅡ时可间歇性用镊子夹住下腔静脉，使得从门静脉注入的solutionⅡ充分消化肝组织。
[0017]优选地，步骤2)中，所述组织分离管为GentleMACS C管，C管中提前加入solution Ⅱ和DNaseⅠ；加入磁珠buffer 5ml终止消化，组织匀浆液中加入1ⅹHBSS缓冲液过100μm细胞筛网。
[0018]优选地，步骤4)中，利用OptiPrep TM密度梯度离心获得肝星状细胞HSC。
[0019]优选地，通过以下步骤获得肝星状细胞HSC：
[0020]4-1)将步骤3)所得上清液50g离心3min(优选重复该步骤三次)，收集非实质细胞悬液，400g离心6min，收集细胞沉淀；
[0021]4-2)将步骤4-1)所得细胞沉淀用17.6％iodixanol(w/v)重悬，充分混匀后缓慢加到15ml离心管中，再轻柔加入10％iodixanol(w/v)，最后在液面最上层加入4ml DMEM，1400g离心21min，不带刹车；
[0022]4-2-1)收集10％iodixanol上层细胞，加入等体积的DMEM，吹打混匀，400g离心6min，弃上清，所得细胞沉淀为小鼠星状细胞HSC。
[0023]优选地，通过以下步骤获得肝血窦内皮细胞LSEC：
[0024]4-2-2)收集17.6％与10％iodixanol之间的细胞层，在收集到的细胞悬液中加入等体积的DMEM，吹打混匀，400g离心6min，弃上清，用磁珠buffer洗细胞一次；
[0025]4-2-3)用磁珠buffer 90μl重悬细胞沉淀，加入10μl anti-LSEC microbeads，4℃，避光孵育15min；磁珠buffer1ml洗细胞，350g离心5min，弃上清；
[0026]4-2-4)磁珠buffer 500μl重悬细胞，细胞悬液转移到MS Columns，细胞悬液滴完后，再用1ml磁珠Buffer洗MS columns；
[0027]4-2-5)在MS Columns中加入适量磁珠Buffer，取下MS Columns，转移到15ml离心管中；
[0028]4-2-6)将得到的细胞悬液350g离心5min，弃上清，加PBS洗细胞两次，即得到小鼠肝血窦内皮细胞LSEC。
[0029]优选地，17.6％iodixanol(w/v)：1.76ml OptiPrep WS(40％)+2.24ml DMEM；[0030]10％iodixanol(w/v)：1ml OptiPrep WS(40％)+3ml DMEM；
[0031]OptiPrep WS(40％)：2ml OptiPrep TM分离液+1ml DMEM；
[0032]DMEM无血清。
[0033]本发明的有益效果在于：
[0034]随着人们对肝脏的不断认识和关注，得到高纯度、高活性的肝非实质细胞逐渐成为研究者最关心的问题。早期最常用的分离方法是淘析离心法(C e n t r i f u-g a l Elutriation)和差速贴壁法。虽然前者能够得到数量可观的细胞，但是其耗时长且依赖于昂贵的超速离心机，难以普及应用；后者操作简便、耗时短，但得到的LSECs纯度不高。近年来，随着流式细胞荧光分选技术(FACS)和免疫磁珠分选技术(MACS)的发展，人们开始使用分子标志物分选细胞。虽然细胞得率低于淘析离心法和差异贴壁法，但却能够保证较高的细胞纯度。其中FACS分离得到的细胞由于细胞活性问题使其受到很大限制，因此依赖于MACS技术的分选方法是目前最有前景的分离手段。本申请首先通过在体灌注消化后，利用组织匀浆器匀浆，并结合密度梯度离心和MACS技术获得了高活性、高纯度的肝非实质细胞。
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