(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010879353.9
(22)申请日 2020.08.27
(71)申请人 云南大学
地址 650091 云南省昆明市五华区翠湖北
路2号
(72)发明人 张毅 杜双林
(74)专利代理机构 重庆航图知识产权代理事务
所(普通合伙) 50247
代理人 王贵君
(51)Int.Cl.
C12N 15/29(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
C07K 14/415(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/46(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
因OsPTD1(Pollen Tube Development)及应用。
该基因编码的蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序
列，或经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸且
具有与OsPTD1蛋白功能相同的蛋白质；SEQ ID
NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质，其核苷酸序
列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开的OsPTD1基
因编码一个抗坏血酸氧化酶，为花粉管正常生长
的必需基因，该基因功能的异常会导致花粉管提
前破裂，不能完成授精，产生配子体雄性不育，可
用于制备配子体雄性不育，在防止转基因随花粉
漂移和繁殖孢子体雄性核不育等方面具有重要
作用。权利要求书1页 说明书6页序列表10页 附图3页CN 112239762 A 2021.01.19
C N 112239762
A
1.一种水稻花粉管生长相关基因OsPTD1，其特征在于：所述水稻花粉管生长相关基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且具有与OsPTD1蛋白功能相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1，其特征在于：所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.2所示序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸且具有与水稻花粉管生长相关基因OsPTD1功能相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1，其特征在于：所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或SEQ ID NO.3所示序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸且具有与水稻花粉管生长相关基因OsPTD1功能相同的核苷酸序列。
4.权利要求1～3任一项所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1在恢复突变体花粉育性中的应用，所述突变体为OsPTD1基因或同源基因变异产生的花粉不育突变体。
5.下调或突变权利要求1～3任一项所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达在制备配子体雄性不育或繁殖孢子体核不育中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的方法为干涉水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述干涉水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的方法是先构建干涉水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的载体，通过农杆菌介导转染植物，筛选转基因阳性植株即可。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述表达载体含有干涉茎环、干涉左臂和干涉右臂，所述干涉茎环的序列如SEQ ID NO.8所示的干涉茎环；所述干涉左臂以SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示序列为引物，从中花11中扩增获得；所述干涉右臂是以SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示序列为引物，从中花11中扩增获得。
9.下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达以制备配子体雄性不育的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将花粉特异启动子调控水稻花粉管生长相关基因OsPTD1的下调元件Xi通过农杆菌介导转染植物，筛选转基因阳性株，转基因阳性株即为配子体雄性不育。
10.下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达以繁殖孢子体核雄性不育的方法，其特征在于：
将某孢子体雄性可育基因Y与启动子POsPTD1调控的OsPTD1基因干涉片段连锁，然后转入孢子体雄性可育基因Y的不育突变体，筛选转基因阳性植株，以阳性植株为父本给孢子体雄性可育基因Y的不育突变体授粉，即可繁殖该孢子体核雄性不育。
权 利 要 求 书1/1页CN 112239762 A
一种植物花粉管生长基因及应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻花粉管生长相关基因OsPTD1及应用，该基因功能异常会产生配子体雄性不育，从而可用来改变花粉育性，控制转基因漂移、制备雄配子体不育和繁殖孢子体雄性核不育等。
背景技术
[0002]植物雄性核不育在花粉发育研究和优势利用中具有重要的作用。雄性不育包括孢子体不育和配子体不育。
[0003]孢子体不育受植株本身的基因型控制，花药中的所有花粉都不育，在田间通常表现花药形态、颜、大小异常，不结实，很容易发现和鉴定；孢子体不育基因既可通过雌配子在世代间传递，也可通过雄配子在世代间传递。而配子体不育受花粉基因型控制，花药中一半花粉可育一半花粉不育，在田间同野生型比无明显差异，结实也正常，难以直接发现和鉴定；雄配子体不育基因只能通过雌配子传递。由于上述差异，使得配子体不育的制备、发现和鉴定非常困难，需要结合室内的显微观察、PCR和电泳等
手段进行，客观上造成配子体不育材料稀少，相关基础和应用研究滞后于孢子体不育。孢子体核不育中的环境不敏感型在优势利用中有极大潜力，但难以单靠自身繁殖出不育彻底，不育株率为100％的体，使得其在应用中受到限制；而配子体雄性不育可用来繁殖孢子体雄性不育。因此，很有必要发现和验证一些配子体雄性不育相关基因，创制一些配子体雄性不育材料。
[0004]植物多铜氧化酶包括漆酶和抗坏血酸氧化酶，参与调控植物的生长发育、繁殖、衰老以及环境胁迫的响应，可调控花期(Shen et al.2009)。水稻中有10多个编码多铜氧化酶的基因，但它们的生物学功能很不清楚，从中到配子体雄性不育相关基因并创制配子体雄性不育，将其用于繁殖孢子体不育以及减少转基因飘逸等具有重要意义。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供控制水稻花粉管发育基因OsPTD1，本发明的目的之二在于提供所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1在恢复突变体花粉育性中的应用，本发明的目的之三在于提供抑制所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达在制备配子体雄性不育中的应用；本发明的目的之四在于提供抑制水稻花粉管生长相关基因OsPTD1基因表达制备配子体雄性不育的方法；本发明的目的之五在于提供利用水稻花粉管生长相关基因OsPTD1下调表达繁殖孢子体核雄性不育的方法及应用(该基因编码氨基酸序列为氨基酸序列如SEQ ID NO.1，该基因CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2，该基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.3)。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]1、一种水稻花粉管生长相关基因OsPTD1，所述水稻花粉管生长相关基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且具有与OsPTD1蛋白功能相同的氨基酸序列；所述水稻花粉管生长相关基因
OsPTD1的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.2所示序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸且具有与水稻花粉管生长相关基因OsPTD1功能相同的核苷酸序列；所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或SEQ ID NO.3所示序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸且具有与水稻花粉管生长相关基因OsPTD1功能相同的核苷酸序列。
[0008]2、所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1在恢复突变体花粉育性中的应用，所述突变体为OsPTD1基因或同源基因变异产生的花粉不育突变体。
[0009]3、下调或突变所述水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达在制备配子体雄性不育或繁殖孢子体核不育中的应用。
[0010]优选的，下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的方法为干扰水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达。
[0011]优选的，所述干扰水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的方法是先构建干涉水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达的载体，通过农杆菌介导转染植物，筛选转基因阳性植株即可。
[0012]优选的，所述表达载体含有干涉茎环、干涉左臂和干涉右臂，所述干涉茎环的序列如SEQ ID NO.8所示的干涉茎环；所述干涉左臂以SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示序列为引物，从中花11中扩增获得；所述干涉右臂是以SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示序列为引物，从中花11中扩增获得。
[0013]4、下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达制备配子体雄性不育的方法，包括如下步骤：
[0014]将花粉特异启动子调控水稻花粉管生长相关基因OsPTD1的下调元件Xi通过农杆菌介导转染植物，筛选转基因阳性株，转基因阳性株为配子体雄性不育。
[0015]5、下调水稻花粉管生长相关基因OsPTD1表达制备孢子体核雄性不育的方法，包括如下步骤：将孢子体雄性可育基因Y与启动子POsPTD1调控的OsPTD1基因干扰片段连锁，然后转入孢子体雄性可育基因Y的不育突变体，筛选转基因阳性植株，以阳性植株为父本给孢子体雄性可育基因Y的不育突变体授粉，即可繁殖该孢子体核雄性不育。
[0016]本发明中，所述孢子体雄性可育基因Y可以为任何孢子体雄性可育基因，如孢子体雄性可育基因OsABCG15，孢子体雄性可育基因Y的不育突变体为中九B-osabcg15：以OsABCG15基因的无花粉雄性
不育突变体为非轮回母本，通过回交获得不育的中九B-osabcg15。也可以选择其他的孢子体雄性可育基因。
[0017]作为一个总的技术方案，本发明所述启动子、干涉片段、终止子和待转物种、品种可灵活选用；孢子体育性基因可灵活选用；基因抑制表达的方式可为干涉、反义和miRNA等；各种片段载入的先后顺序和相对位置可根据具体情况调整。另外，在方法陈述中所用的载体名称仅仅是为了陈述方便而使用，并不限制在实际应用中使用其他符号来表示相关载体。因而，上述可选内容的实际采用不表明同本发明有实质性差异，从而不影响本发明的保护。
[0018]本发明的有益效果在于：OsPTD1是水稻内源性基因，通过对其进行下调表达，无需借助外源基因或片段，即可产生配子体不育，从而培育转基因成分不随花粉漂移的植物品种(如果在其他物种中使用本方法，可选用目标物种中的配子体不育相关基因进行)；还可
用来繁殖孢子体核不育，解决孢子体不育的繁殖问题，从而有利于自由选用父本，充分利用优势；所述制备和鉴定配子体雄性不育的方法具有直观，简单，准确，省时，经济等优点。
附图说明
[0019]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0020]图1为OsPTD1基因表达谱分析(A为OsPTD1基因在野生型各器官和花发育各时期和在干涉纯合后代花发育后期表达的RT-qPCR分析；B为启动子POsPTD1驱动GUS基因在花粉中特异表达的GUS染检测，示转基因杂合体花粉的GUS染；C为启动子POsPTD1驱动GUS基因在花粉中特异表达的GUS染检测，示转基因纯合体花粉的GUS染)；
[0021]图2为OsPTD1基因的RACE分析和cDNA全长扩增(A和B分别为5和3端的3轮扩增，C为cDNA全长扩增)；
[0022]图3为载体改造图谱；
[0023]图4为花粉萌发情况(A为野生型花粉，B为干涉T0代花粉(大约一半花粉提前破裂))；
[0024]图5为转基因T0代阳性株杂交F1中紫线的传递情况。
具体实施方式
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0026]在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本
发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第四版，冷泉港实验室出版)或精编分子生物学实验指南(第五版，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027]实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。[0028]相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库，或基因组DNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0029]实施例1、雄配子体功能相关基因OsPTD1的选定：
[0030]为了到一些配子体发育相关基因，我们对BAR水稻基因表达数据库( bar.utoronto.ca/efprice/i)进行分析，发现很多在中后期花中表达的基因，经RT-qPCR验证，选出一批可能同雄配子体发育相关的基因。其中，水稻Loc_ Os05g40740基因在后期花中特异高表达，其拟南芥的同源基因在花粉中特异表达，初步将
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