(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811067437.1
(22)申请日 2018.09.13
(71)申请人 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公
司
地址 430000 湖北省武汉市中国（湖北）自
贸区武汉片区高新二路388号武汉光
谷国际生物医药企业加速器一期工程
厂房1单元808室
(72)发明人 冷毅斌 张念元
(74)专利代理机构 武汉蓝宝石专利代理事务所
(特殊普通合伙) 42242
代理人 廉海涛
(51)Int.Cl.
G01N 33/533(2006.01)
G01N 33/561(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)G01N 33/53(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种ECL底物液及其制备方法和
应用，该ECL底物液包括如下浓度的组分：鲁米诺
0.15g/L -0.50g/L、1-溴-2-萘酚0.15g/L -0.50g/
L、EDTA 0.15g/L -1.00g/L、过氧化脲0.03g/L -
0.20g/L、聚乙二醇1.00g/L -5.00g/L、生物防腐
剂0.05mL/L -0.50mL/L和pH 9.0的柠檬酸缓冲液
0.2mol/L -0.6mol/L。该ECL底物液通过特定组分
以增强底物荧光，在蛋白质免疫印迹实验过程中
能够最大程度地提高检测灵敏度，减少背景值，
且热稳定性好，
可以长期存放。权利要求书2页 说明书6页 附图1页CN 109085338 A 2018.12.25
C N 109085338
A
1.一种ECL底物液，其特征在于，包括如下浓度的组分：
2.根据权利要求1所述的ECL底物液，其特征在于，包括如下浓度的组分：
3.根据权利要求2所述的ECL底物液，其特征在于，包括如下浓度的组分：
4.根据权利要求1至3任一项所述的ECL底物液，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000-20000。
5.根据权利要求4所述的ECL底物液，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为5000-8000。
6.根据权利要求1至3任一项所述的ECL底物液，其特征在于，所述生物防腐剂为
Proclin300。
7.一种权利要求1至6任一项所述的ECL底物液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照权利要求1至6任一项所述的ECL底物液的组成称量各组分；
将鲁米诺、1-溴-2-萘酚、EDTA、过氧化脲和聚乙二醇用水溶解，再加入生物防腐剂，定容，即得。
8.权利要求1至6任一项所述的ECL底物液在蛋白免疫印记检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的ECL底物液在蛋白免疫印记检测中的应用，其特征在于，所述蛋白免疫印记检测的蛋白质为磷酸化蛋白。
10.根据权利要求9所述的ECL底物液在蛋白免疫印记检测中的应用，其特征在于，所述磷酸化蛋白为磷酸化P53蛋白。
ECL底物液及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ECL底物液及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]免疫印迹法(Westernblotting，简称“WB”)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。
[0003]蛋白质磷酸化指由蛋白质激酶催化的把三磷酸腺苷(ATP)的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上的过程，或者在信号作用下结合鸟苷三磷酸(GTP)，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
[0004]p53是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞对DNA损伤或基因组异常响应过程中起关键作用。p53激活可以导致细胞周期阻滞(cell cycle arrest)，DNA修复或细胞凋亡。MDM2蛋白是p53的E3泛素连接酶(E3ligase)，可以导致p53的泛素化修饰并被蛋白酶体降解。p53可以被多种蛋白激酶在多个位点磷酸化修饰。DNA损伤诱导的p53Ser15和Ser20磷酸化可以减弱p53和其负调控因子MDM2蛋白的结合。p53可以被ATM、ATR和DNA-PK等在Ser15和Ser37位磷酸化，从而抑制p53的泛素化降解，促进p53的激活和积累。Chk1和Chk2可以磷酸化p53的Ser20，促进p53的四聚化，增强其稳定性和活性。p53的Ser46磷酸化和其诱导细胞凋亡密切相关。p53的Ser392可以被CAK磷酸化，该位点磷酸化和p53的抑制生长功能及其DNA结合和转录激活有关。p53可以被p300和CBP乙酰化修饰，可以被Sirt1去乙酰化修饰。p53
的乙酰化修饰可以促进其在应激反应中的累积和激活。
[0005]目前WB检测过程中，当底物发生化学反应产生的能量以光的形式释放出来的时候，我们称这个过程为化学发光。鲁米诺是最常用的化学发光试剂之一，被过氧化物氧化后它会产生一种激发态的产物。这种激发态产物衰变至低能态的同时会释放出光子。然而，磷酸化蛋白的含量比较低，在WB检测过程中经常会遇到采用常规鲁米诺底物液时表达丰度低导致检测不出来的情况，这个主要原因是使用常规鲁米诺底物液的灵敏度比较低，并且现在没有特异性针对磷酸化蛋白检测中的应用。也就是常规的ECL底物液灵敏度较低，在磷酸化抗体的检测上不能达到良好的效果。
发明内容
[0006]基于此，有必要针对提供一种能够提高磷酸化蛋白检测灵敏度的ECL底物液及其制备方法和应用。
[0007]一种ECL底物液，包括如下浓度的组分：
[0008]
[0009]在其中一个实施例中，所述的ECL底物液包括如下浓度的组分：
[0010]
[0011]在其中一个实施例中，所述的ECL底物液包括如下浓度的组分：
[0012]
[0013]在其中一个实施例中，所述聚乙二醇的分子量为1000-20000。
[0014]在其中一个实施例中，所述聚乙二醇的分子量为5000-8000。
[0015]在其中一个实施例中，所述生物防腐剂为Proclin300。
[0016]一种上述任一项所述的ECL底物液的制备方法，包括如下步骤：
[0017]按照上述任一项所述的ECL底物液的组成称量各组分；
[0018]将鲁米诺、1-溴-2-萘酚、EDTA、过氧化脲和聚乙二醇用水溶解，再加入生物防腐剂，定容，即得。
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