(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202111517229.9(22)申请日 2021.12.13
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 113907040 A (43)申请公布日 2022.01.11
(73)专利权人 天津医科大学总医院空港医院地址 300308 天津市滨海新区空港经济区
东六道85号(72)发明人 张鹏 李仕聪 官宝礼 张金霞
宋世辉 王欢 (74)专利代理机构 天津企兴智财知识产权代理
有限公司 12226
代理人 薛萌萌(51)Int.Cl.
A01K 67/02(2006.01)(56)对比文件
CN 104873290 A ,2015.09.02CN 201048504 Y ,2008.04.23CN 108796064 A ,2018.11.13
CN 111904381 A ,2020.11.10
CN 211583981 U ,2020.09.29CN 209527483 U ,2019.10.25徐娇阳，是文辉，姜婧，王铮２，王瑞，邹红云，余伍忠，桂俊豪.模拟6000ｍ海拔低压低氧性肺动脉高压大鼠模型的建立及意义.《西北国防医学杂志》.2015，第36卷(第5期)，第300~303页.
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审查员 王珊
(54)发明名称
一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法(57)摘要 本发明提供一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法。首先设定升海拔、维持高海拔、降海拔三个阶段，模拟8500米海拔，持续运行时间达216小时，限制模拟海拔变化速率为0.45±0.04m/s，使舱内气流稳定、气体均质和氧含量恒定，最终获得急性HAMI动物模型。此外，通过18F ‑FDG PET/CT心肌代谢显像、小动物心脏超声，结合FITC ‑BSA血管渗漏实验、心肌病理特殊染等手段进行模型相关的特征性改变验证。本发明的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，明确成模所需的优化装置及相关特定参数条件，通过多模态联合验证手段，对该模型进
行了特征性描述，为本领域相关研究提供了稳定
可靠且可连续观察的动物模型。
权利要求书2页 说明书13页 附图5页
CN 113907040 B 2022.03.11
C N 113907040
B
1.一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，将实验动物置于低压低氧动物模型舱内饲养，其特征在于：所述建立方法包括以下步骤：
（1）升海拔阶段，真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，使模型舱内的气压及含氧量降低，模拟升海拔从模拟海平面至8500米；
（2）维持高海拔阶段，真空泵组件的两个真空泵交替间隔12小时，以维持模型舱内氧气总量与模拟海拔8500米氧气总量相同，维持8500米高海满足实验要求的长时间运行，实验总时长达到216小时；
（3）降海拔阶段，真空泵组件的抽气速度小于补气组件的补气速度，使模型舱内的氧气总量不变，气压升高，模拟降海拔从高度8500米降至模拟海平面，海拔变化速率为0.45±0.04m/s。
2.根据权利要求1所述的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于，对动物模型通过以下方法中的两种以上进行实验验证：
（1）对动物模型进行18F‑FDG心肌代谢显像验证心肌代谢改变；
（2）对模型进行小动物心脏超声实验验证心脏结构影像学改变；
（3）对模型进行FITC‑BSA毛细血管渗漏实验；
（4）对模型心肌组织进行多种病理特殊染实验；
（5）对模型的多模态验证，至少采用两组方法横向比较达到对心肌细胞损伤、炎症细胞浸润、血管渗漏、心肌纤维化程度的连续观察。
3.根据权利要求2所述的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于，对动物模型进行18F‑FDG心肌代谢显像实验，包括以下步骤：
（1）配制18F‑FDG工作液将18F‑FDG原液稀释至0.5‑1.2μCi/μL；
（2）麻醉动物模型，将18F‑FDG工作液经尾静脉注射75‑250μCi;
（3）注射18F‑FDG工作液后30‑120min上机进行PET/CT显像，勾画心脏感兴趣区，计算心脏SUVmean值；
（4）进行18F‑FDG心肌代谢显像连续实验，动物模型心肌代谢显像随时间增长SUVmean值先逐渐升高，以后逐渐降低。
4.根据权利要求2所述的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于：使用FITC‑BSA对动物模型进行心肌组织冰冻免疫荧光病理显像，包括以下步骤：（1）配置0.5‑2.0ug/μL的 FITC‑BSA溶液，经尾静脉注射50‑200μL；
（2）间隔2～4小时后解剖留取动物模型心脏组织行冰冻切片；
（3）在荧光显微镜下动物模型的血管外组织间质荧光增强。
5.根据权利要求2所述的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于：多种病理特殊染实验检查动物模型的心肌改变包括：
HE染、Masson染、免疫组化CD163染和免疫组化CD34染验证动物模型的心肌细胞损伤、进行性纤维化、巨噬细胞浸润和新生毛细血管增生情况。
6.根据权利要求2中所述一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于：18F‑FDG心肌代谢显像联合小动物心脏超声对动物模型进行心脏结构与功能检测。
7.根据权利要求2中所述的一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于：18F‑FDG心肌代谢显像联合FITC‑BSA血管渗漏实验、心肌CD34免疫组化染验证动
物模型心肌毛细血管渗漏。
8.根据权利要求2中所述的一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，其特征在于：18F‑FDG心肌代谢显像、小动物心脏超声、心肌HE染和心肌Masson染验证动物模型存在随时间加重心肌纤维化表现。
一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法。
背景技术
[0002]高原环境的主要特点是低气压缺氧，海拔3000米氧含量相当于海平面的75%，生活在低海拔地区人员，紧急进入海拔3500米以上的高原，短期暴露一段时间后可能导致急性心肌损伤。
[0003]世界卫生组织和国际心脏病联合会（WHO/ISFC）将急性高原性心肌损伤定义为系统的疾病，并明确为特异性心肌病。根据暴露于低压缺氧的时间不同可分为：急性低压低氧，代表暴露在高海拔数小时或数天的人(游客和登山者)患病。慢性低压低氧，代表长期生活在高海拔地区的暴露人患病。慢性间歇性低压低氧，这种类型指的是通勤于高海拔地区工作的暴露人患病。
[0004]由于急性暴露低大气压、低氧分压（Hypobarichypoxia，HH）环境，可诱发血氧供应/需求失衡的心肌缺血损伤，即高原心肌损伤(HAMI)。该损害导致病理生理改变与冠心病、病毒、药物和免疫等引起心肌病的改变特点有本质的区别。这种急性暴露HAMI有救治困难和死亡率高的特点。
[0005]目前认为急进高原低压低氧环境后，机体内活性氧自由基（ReactiveOxygenSpecies，ROS）产生过多，直接损伤心肌细胞蛋白结构。此外，ROS引起HIF‑1α在心肌细胞中的聚集，介导炎症反应的发
生，导致心血管系统损伤。高原低压低氧环境可以刺激交感神经兴奋，长期作用于心肌β受体，使心肌细胞发生凋亡和心室重塑。上述影响最终导致心力衰竭。
[0006]近年来，虽然一些研究揭示了HH引起动物模型心脏一系列的病理反应（包括生化、分子和基因组的改变）和器官损伤分子水平的变化。到目前为止，其损伤发病的机制尚不完全清楚，严重阻碍了HAMI防治。因此，提高实验模型舱的性能，制备急性HAMI动物模型，确定更加全面的模型评价体系，对后续研究HH引起急性HAMI的原因、机制及防治及其重要。[0007]实验性急性HAMI动物模型是低压低氧心肌损伤研究的基础，而成功建立此模型需要改进两个目前存在的关键问题：1.低压低氧动物模型舱实验条件参数设置不准确；2.急性HAMI动物模型未采用多模态参数验证。
[0008]应着力解决上述问题，提高建立模型质量。
发明内容
[0009]有鉴于此，本发明旨在提出一种急性HAMI动物模型建立方法，通过精准设置低压低氧动物模型舱的必要实验参数，获得稳定的急性HAMI动物模型，获得多模态的实验参数验证。
[0010]本发明的技术方案是这样实现的：
[0011]一种急性高原低压低氧心肌损伤动物模型建立方法，将实验动物置于低压低氧动物模型舱内饲养，
[0012]所述建立方法包括以下步骤：
[0013]（1）升海拔阶段，真空泵组件的抽气速度大于补气组件的补气速度，使模型舱内的气压及含氧量降低，模拟升海拔从模拟海平面至8500米；
[0014]（2）维持高海拔阶段，真空泵组件的两个真空泵交替间隔12小时，以维持模型舱内氧气总量与模拟海拔8500米氧气总量相同，维持8500米高海满足实验要求的长时间运行，实验总时长达到216小时；
[0015]（3）降海拔阶段，真空泵组件的抽气速度小于补气组件的补气速度，使模型舱内的氧气总量不变，气压升高，模拟降海拔从高度8500米降至模拟海平面。
[0016]进一步地，海拔变化速率为0.45±0.04m/s。
[0017]一种如上方法建立的急性高原低压低氧心肌损伤动物模型，对模型通过以下方法中的一种或几种进行实验验证：
[0018]（1）对动物模型进行18F‑FDG心肌代谢显像验证心肌代谢功能；
[0019]（2）对模型进行小动物心脏超声实验验证心功能改变；
[0020]（3）对模型进行FITC‑BSA毛细血管渗漏实验；
[0021]（4）对模型心肌组织进行多种病理特殊染实验；
[0022]（5）对模型进行多模态验证，至少采用两种方法横向比较达到对心肌细胞损伤、炎症细胞浸润、血管渗漏、心肌纤维化程度的一致性无创、连续观察。
[0023]进一步地，对动物模型进行18F‑FDG心肌代谢显像实验，包括以下步骤：
[0024]（1）配制18F‑FDG工作液将18F‑FDG原液稀释至0.5‑1.2μCi/μL；
[0025]（2）麻醉动物模型，将18F‑FDG工作液经尾静脉注射75‑250μCi;
[0026]（3）注射18F‑FDG工作液后30‑120min上机进行PET/CT显像，勾画心脏感兴趣区，计算心脏SUVmean值；
[0027]（4）进行18F‑FDG心肌代谢显像连续实验，动物模型心肌代谢显像随时间增长SUVmean值先逐渐升高，以后逐渐降低。
[0028]进一步地，使用FITC‑BSA对动物模型进行心肌组织冰冻免疫荧光病理显像，包括以下步骤：
[0029]（1）配置0.5‑2.0ug/μL的 FITC‑BSA溶液，经尾静脉注射50‑200μL；
[0030]（2）间隔2～4小时后解剖留取动物模型心脏组织行冰冻切片；
[0031]（3）在荧光显微镜下动物模型的血管外组织间质荧光增强。
[0032]进一步地，多种病理特殊染实验检查动物模型的心肌改变：
[0033]HE染、Masson染、免疫组化CD163染和免疫组化CD34染验证动物模型的心肌细胞损伤、进行性纤维化、巨噬细胞浸润和新生毛细血管增生情况。
[0034]进一步地，18F‑FDG心肌代谢显像联合小动物心脏超声对动物模型进行心脏结构与功能进行一致性无创、连续观察。
[0035]进一步地，18F‑FDG心肌代谢显像联合FITC‑BSA血管渗漏实验、心肌CD34免疫组化染验证动物模型心肌毛细血管渗漏。
[0036]进一步地，18F‑FDG心肌代谢显像、小动物心脏超声、心肌HE染和心肌Masson染
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