刘青，赵恒寿
(山西农业大学动物科技学院，太原030801)
摘要：主要介绍攻毒成活率，免疫器官体指数，免疫细胞活性，以及组织、血液、体液中微观的免疫成分等反映机体免疫状况的指标及其检测方法。在研究鱼类免疫性能时，应采用攻毒成活率作为综合评价指标；免疫器官体指数、免疫细胞活性作为组织、细胞水平的免疫指标，检测方法相对简单易行；而微观的免疫成分检测较为复杂，可根据试验需要选择部分指标。上述指标与鱼体免疫机能正相关，检测方法在不同试验动物或试验条件下可适当调整。关键词：鱼类；免疫；检测技术 基金项目：山西农业大学青年创新基金(2005009)
近些年来，鱼类免疫学研究受到广泛重视，在王子灿
鱼病防治、营养添加剂、水域生态环境的研究中，往往会涉及一些免疫指标的检测。鱼类的免疫状况可由其机体的相应指标变化来反映。目前很多研究者所采用的免疫指标和指标的检测方法不尽相同，笔者拟对鱼类常用免疫指标及其检测方法作一探讨。
1成活率
成活率=(攻毒试验结束存活鱼数/攻毒试
验开始鱼总数)×100%
相对成活率(RPS )=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%
选取不同的病原体或者其它物质对试验鱼攻毒，在一定时间内以最终成活率来衡量鱼类机体免疫力，通常成活率越高，其疾病抵抗能力越强。
淡水鱼类多采用危害较大的嗜水气单胞菌[1]
注
射或者浸泡攻毒[2-6]
，海水鱼类多采用不同种类
弧菌攻毒[7-10]
。除细菌外，还可采用病毒进行攻毒试验[11]
。
鱼类免疫后的成活率可以综合反映鱼类的抗病力及免疫力，在试验中采用该指标能够直接而可信地评价鱼体免疫机能。
2 免疫器官重量
[6,16]
2.1 头肾体指数(Head Kidney Body I ndex,HK 2
B I )
肾脏是成鱼最重要的淋巴组织，可分为头肾
和中肾。成鱼的头肾失去排泄功能，但保留了造
血和内分泌的功能。受抗原刺激，头肾和中肾细胞出现增生，表现为肾脏重量变化，肾脏也是硬骨鱼类重要的抗体产生器官。笔者研究建鲤免疫性能时检测上述两种免疫器官指数，其变化与鱼体免疫性能密切相关。在摘取头肾时应注意摘取全部头肾，否则可能造成试验结果的较大偏差。
头肾体指数=(头肾重量/体重)×100%
测算方法：先称量鱼体重，然后断尾放血摘取头肾，生理盐水稍加冲洗，吸水纸吸干表面水分，立即称重，根据记录数据上式计算。2.2 脾脏体指数(Sp leen Body I ndex,S B I )
硬骨鱼类的脾脏在造血和免疫反应方面都起着重要的作用。脾脏是红细胞、中性白细胞和粒性白细胞生成、贮存与成熟的主要器官。其重量变化与机体免疫状况变化密切相关。
脾脏体指数=(脾脏重量/体重)×100%
测算方法与同头肾体指数相同。
3 免疫细胞活性
参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、辅佐细胞等，在免疫应答过程中均发挥作用。它们的形态、数量和活性均能反映机体的免疫功能。3.1 淋巴细胞转化率
淋巴细胞转化率=100%×(过渡型细胞+母细胞)/淋巴细胞总数
取0.5mL 抗凝血，无菌操作加入含有PHA
(植物血凝素)营养液的小瓶内混合,37℃恒温培养,3～4d后去上清液，加入37℃预温的0.87%的NH
4
Cl溶液3mL，溶解红细胞，离心、制片，根据淋巴细胞转化的形态特征[12]采用形态学观察法观察200个淋巴细胞，计算淋巴细胞转化率。3.2 红、白细胞数
红、白细胞的数量也能反映机体的免疫水平。Kollner等[13]给虹鳟注射杀鲑气单胞菌灭活疫苗后，发现在15℃时，血液和脾脏中白细胞数量显著增加。
红细胞：取20μL全血用生理盐水稀释200倍后，在Neubauer计数板上计数。
白细胞：取20μL抗凝血加入盛有380μL白细胞稀释液(98mL蒸馏水加入冰醋酸2mL和3滴1%亚甲兰)的试管中，溶解全部红细胞后，取白细胞悬液，低倍镜下计数。
3.3 白细胞吞噬指数(P I)和吞噬百分比(PP)
白细胞吞噬指数(P I)=100个多核型白细胞中含菌总数/100
吞噬百分比(PP)=(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100
白细胞的吞噬活性与机体免疫状况密切相关，为非特异性免疫重要指标。吞噬菌体可为福尔马林灭活
金黄葡萄球菌或白葡萄球菌[5,14,15]，在0.1mL抗凝血中加入0.05mL菌浓度1.0×108菌液，充分混匀,25℃恒温水浴孵育60m in，每隔10m in摇动1次。1000r/m in离心5m in，用吸管吸取白细胞层涂片，每个样品涂片3张，快干时滴甲醇固定约8m in，蒸馏水冲洗后，用W right氏染液染15m in，自来水冲洗后再蒸馏水冲洗，晾干后用镜观察。也可采取抗凝全血中加入吞噬菌，孵育后直接涂片观察，操作比吸取白细胞层观察简单，但视野下白细胞密度较低。
3.4 巨噬细胞活性
吞噬指数=200个巨噬细胞中所吞噬的菌体总数/200
吞噬活性的测定:W right氏染,Gie m sa复染，镜检，光镜下计数200个巨噬细胞，以吞噬指数表示其吞噬活性[16]。
4 血液、体液免疫成分检测
鱼类血液和体液中不仅有多种免疫细胞，还有多种免疫物质，检测其中的一些指标变化可以吉林都市110
反映鱼体免疫状况。检测免疫酶类活性时可购买市售针对不同酶类的试剂盒参照说明进行检测，较为简便。
4.1 体表粘液[17]
粘液中也含有免疫物质，如溶菌酶、免疫球蛋白M(I g M)等。用灭菌生理盐水冲洗鱼体1～2次，吸去多余水分，再用洁净玻片从鳃盖后缘开始轻刮体表粘液，在尾部收集刮下的粘液于灭菌离心管中。粘液在4℃冰箱中放置2～4h，或4℃低速离心，去除管底重力水，称重并记录数据。将粘液用生理盐水稀释10倍，冰浴匀浆后,4℃下离心(10000r/m in,20m in)，取上清液待测。4.2 抗体检测
硬骨鱼类只有产生一类免疫球蛋白，即I g M，鱼类的I g M为四聚体，而哺乳动物的I g M为五聚体。鱼类的I g M还存在于皮肤、肠粘液、胆汁和卵，对机体免疫作用非常重要。鱼类抗体检测方法常见的有：微量血凝板法[2-5,9]和酶联免疫吸附法(EL I S A)[8,18]。
微量血凝板法：以血清中抗体为例，用取样器吸取0.1mL血清加入经灭菌的U型底96孔板每行的第1孔内，在该行的其他孔内加入0.05mL无菌P BS(磷酸盐缓冲溶液)，第1孔内取0.05mL血清加入同行第2孔内，混匀后再从第2孔内取0.05mL液体加入同行后一孔内，如此重复，做2倍序列稀释，再在每个孔内加入0. 05mL活的或灭活的菌液,37℃孵育，过夜后观察，出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。该法操作较为简单，黑背景衬托下结果也较为明显，但特异性比E L I S A法略差。
酶联免疫吸附法：特异性和灵敏性接近放射免疫法，反应的结果易于观察，可作多种抗原和抗体的定量测定，但检测方法较为复杂，成本较高。
4.3溶菌酶(LSZ)活力
溶菌酶活力计算公式:X
华瑞营养学院
LSZ
=(A0-A)/A 溶菌酶活力为非特异免疫的重要指标。通常检测鱼类血液或粘液中溶菌酶活力[5,9,16]。以溶壁微球菌冻干粉为底物，用pH6.4的磷酸钾缓冲溶液配底物悬液，取200μL该悬液与20μL待测
血清于96孔酶标板中混匀，于570nm处测其A
值，然后将酶标板取出，置于37℃水浴中温浴10m in后立即冰浴终止反应，再测其A值。
4.4碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)[17]
高等动物的酸性磷酸酶作为体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢，主要存在于各脏器、血细胞和骨髓中。在鱼类免疫研究中，也测定组织器官或血清中的磷酸酶活性。磷酸苯二钠法测定组织或血清中AKP或ACP活力，定义为1g组织蛋白或100mL 血清在37℃与底物作用15m in产生1mg酚为单位。
4.5超氧化物歧化酶(S OD)
超氧化物歧化酶活性与机体免疫水平密切相关，对于增强巨噬细胞的防御功能和整个机体的免疫机能有重要作用，常作为机体非特异免疫功能指标。S OD活力定义为:1mL反应液中S OD 抑制率达50%时所对应的S OD的量为1个亚硝酸盐单位。根据试验需要，可以分别检测总S OD (T2S OD)、铜锌S OD(ZnCu2S OD)和锰S OD(Mn2 S OD)，如笔者在考察锌对鲤鱼免疫性能影响时就检测ZnCu2S OD活性。
4.6酚氧化酶
在虾类免疫功能评价中，血清酚氧化酶活性经常作为检测指标，也有研究者把酚氧化酶活性作为鱼类检测免疫指标。如Cuesta等[19]报道对金鲷饲喂含高剂量VA(300mg/kg)的饵料后，其白细胞酚氧化酶(MP O)含量提高。血清酚氧化酶测定方法：以L2二羟苯丙氨酸(L2DOP A)为底物，将pH6.0的磷酸钾缓冲液与0.01mol/L的L2DOP A0.1mL及0.1mL待测血清于室温下混匀，每隔2m in测定其光密度值A
490
n m，以A490n m 对反应时间作图，以每分钟增加0.001为1个酶活力单位。
4.7 血清补体活性测定[9,20]
补体是机体抵抗微生物感染的重要成分。C3是补体系统的主要成分之一，可以通过经典或旁路途径激
活。在盛有0.5mL致敏羊红细胞(SRBC)的试管中，加入0.5mL鱼血清(空白对照组加入0.85%的NaCl溶液，全溶对照组加入0.04%氨溶液)，使血清的终浓度为3%；置于培养箱中38℃孵育60m in，然后经2000r/m in离心10m in，取上清液，用紫外可见分光光度计在541nm下测光密度值(A)。
以上介绍的为鱼类常用免疫指标。在考察鱼体免疫功能时，可选其中部分免疫指标进行检测，上述指标与机体免疫机能均为正相关。同一指标也有不同的检测方法，根据不同研究对象可适当变动，检测时应根据试验要求、设备条件等采用适当的检测指标和方法。□
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(下转第27页)
一般5月中下旬放养，虾苗规格在0.4～0.5c m，每亩放8～10万尾。若经中间强化培育，规格达1.0c m以上者，每亩5～6万尾;
1.5c m以上，则每亩4～5万尾。
2.3饵料投喂
饵料种类：虾苗规格在3.0c m以前，应以天然饵料为主，此时应保持池水较肥，天然饵料较丰富，同时适当投喂前期料；幼虾长到3.0c m以上时，以对虾颗粒饲料为主，其粗蛋白含量要求在30%以上；规格在6c m以上时，可辅投一些经破碎的螺蚬类、小杂鱼等。
投喂方法：周氏新对虾虾具有昼伏夜出的生活习性，喜欢在池边活动觅食。沿虾池四周浅水处投喂，日投饵2次，白天投喂日投饵量的1/3，傍晚投喂2/3，生长旺季夜间增投1次。
2.4日常管理
虾苗下池时水深50c m,10d后，每隔7d加水1～2次，每次加水10～20c m，水深保持1.5m。水满后，定期放掉底层水，让阳光尽可能深地照射水体，使整个水体成为富氧区，加速脱壳。适时追肥及机械增氧；不定期每亩用10～15kg生石灰进行全池泼洒，以改良底质和水质。
保持水质pH7～9，溶解氧不低于4mg/L，水呈黄绿或茶褐，透明度保持在35～45c m。放养初期水位约80c m，以后每10d或大潮汛加大换水量，特别在高温时要加深水位，经常进排水，保持水质清新。□
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【作者简介】叶建生(1981—)，男，中国海洋大学在读硕士研究生，主要从事经济水产动物营养、生理生态及免疫学研究。
通讯作者：王兴强(1975—)，男，副教授，博士，主要从事水产动物营养、生理生态学研究。
(2007204212收稿;2007205221修回)
(上接第30页)
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【作者简介】刘青(1980—)，男，助教，主要从事水产动物养殖技术和营养免疫研究。
通讯作者：赵恒寿(1955—)，男，教授，博士生导师，主要从事动物药品与疾病防治研究。
(2007204223收稿;2007206213修回)
(上接第35页)
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【作者简介】苏捷(1980—)，男，研究实习员，硕士，主要从事海洋生物毒素和水产加工研究。
(2007205224收稿;2007206205修回)
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