(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910644324.1
(22)申请日 2019.07.17
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M 2019465 2019.06.19
CCTCC NO:M 2019464 2019.06.19
(71)申请人 上海科技大学
地址 201210 上海市浦东新区华夏中路393
号
(72)发明人 季泉江 王宇
(74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司
31001
代理人 翁若莹
(51)Int.Cl.
C12N 15/74(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)C12R 1/01(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种双质粒系统，其特征在
于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒命
名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：
1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。本发明能够
变。所述的技术对于鲍曼不动杆菌的基因功能研
究、耐药机制解析、新药物靶点筛选、新方法
开发等方面具有广阔的应用前景。权利要求书1页 说明书15页序列表20页 附图2页CN 110423771 A 2019.11.08
C N 110423771
A
1.一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒能够表达Cas9蛋白和RecAb重组酶，所述第二质粒能够表达sgRNA。
2.如权利要求1的所述的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组
酶系统基因片段、tac promoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb 重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达。
3.如权利要求1的所述的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒包含aprR阿布拉霉素抗性基因片段与sacB蔗糖筛选基因片段。
4.一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒和第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。
5.权利要求1～4中任一项所述的双质粒系统在鲍曼不动杆菌株的基因编辑中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑为基因插入、基因敲除或单碱基突变中的一种。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因敲除中的敲除基因为oxyR基因。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因插入是以iscA基因与hscB基因的间隙作为插入位点，以表达紫素蛋白的amilCP基因作为插入基因。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的单碱基突变为oxyR基因中第605位的鸟嘌呤碱基突变为胞嘧啶碱基。
10.含有pCasAb质粒和pSGAb质粒中的至少一种的菌株。
权 利 要 求 书1/1页CN 110423771 A
双质粒系统及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统及其应用。
背景技术
[0002]鲍曼不动杆菌是一种危害性极大的革兰氏阴性人类病原细菌，能够引起一系列严重的医院获得性感染，如败血症、肺炎、心内膜炎和继发性脑膜炎等严重感染性疾病，且极易在患者、医护人员之间进行传播。鲍曼不动杆菌强大的致病和传播能力主要归因于两个方面。一方面，鲍曼不动杆菌具有耐受干燥和多种消毒剂的能力，使其能够在临床医疗材料表面长时间存活，难以被完全杀灭；另一方面，鲍曼不动杆菌能够摄取外源耐药基因，获得对包括碳青霉烯和多粘菌素类抗生素在内的多种抗生素的抵抗能力，其感染人体后很难到有效的抗生素药物。近几十年来，随着抗生素的广泛使用，由多重耐药性甚至全耐药性鲍曼不动杆菌造成的临床感染病例正快速增加，进一步增加了难度。在世界卫生组织(W
HO)公布的抗生素耐药“重点病原体”清单中，碳青霉烯类耐药性鲍曼不动杆菌位列第一名，强调了新型药物靶点筛选和新型方法开发的重要性和迫切性。
[0003]新型药物靶点的筛选离不开基因组层面的基因组编辑操作和后续的基因功能研究。用于鲍曼不动杆菌基因组编辑操作的现有技术主要有非复制许可质粒法和外源重组酶法。这两种方法的操作较为复杂，基因敲除效率较低，需要耗费大量的人力物力，且难以实现精确的无痕基因组编辑，极大地阻碍了鲍曼不动杆菌的基因功能研究，因此迫切需要开发一种适用于鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑系统。
[0004]CRISPR-Cas9系统是一种近年来开发的新型基因组编辑工具，具有强大的DNA定点切割能力。该系统源自原核生物的获得性免疫系统，是原核生物进化出来的一种用于抵抗外源核酸入侵和噬菌体感染的主动免疫系统。目前使用最为广泛的CRISPR-Cas9系统由来自化脓链球菌的Cas9核酸酶和人工嵌合单向导RNA(sgRNA)两部分组成。sgRNA能够与Cas9蛋白结合形成复合物，识别PAM位点上游能够与sgRNA的5’端的20bp spacer序列互补配对的靶标位点，并对其进行切割，造成DNA双链断裂。
[0005]CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA产生双链断裂后，细菌只有通过同源重组修复DNA双链断裂才能存活。此时通过导入人工设计的同源修复模板，便可以通过同源重组修复，实现靶基因的精确定向编辑。然而，现行的CRISPR-Cas9系统还具有很大的局限性，不能直接用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，需要进一步探索和开发，才能实现鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑。
发明内容
[0006]鉴于现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统，用于解决现有技术中的问题。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种双质粒系统，其特征在于，包
含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒能够表达Cas9蛋白和RecAb重组酶，所述第二质粒能够表达sgRNA。
[0008]优选地，所述第一质粒包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达。[0009]更优选地，所述RecAb重组酶系统包含beta和exo基因片段。
[0010]优选地，所述第一质粒包含aprR阿布拉霉素抗性基因片段。
[0011]优选地，所述第一质粒包含sacB蔗糖筛选基因片段。
[0012]一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。
[0013]本发明还提供了上述的双质粒系统在鲍曼不动杆菌株的基因编辑中的应用。[0014]优选地，所述的鲍曼不动杆菌株为鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株。
[0015]优选地，所述的基因编辑为基因插入、基因敲除或单碱基突变中的一种。[0016]更优选地，所述的基因敲除中的敲除基因为oxyR基因。
[0017]更优选地，所述的基因插入是以iscA基因与hscB基因的间隙作为插入位点，以表达紫素蛋白的amilCP基因作为插入基因。
[0018]更优选地，所述的单碱基突变为oxyR基因中第605位的鸟嘌呤碱基(G)突变为胞嘧啶碱基(C)。
[0019]本发明还提供了含有上述的pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2019464。
[0020]本发明还提供了含有上述的pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2019465。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0022]本发明涉及在鲍曼不动杆菌中基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术形成的pCasAb/pSGAb双质粒系统以及相关应用。本发明的pCasAb/pSGAb双质粒系统能够高效、省时并且无痕地实现对鲍曼不动杆菌的基因组编辑，其中包括基因敲除、基因插入和单碱基突变。
[0023]含有pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019464。
[0024]含有pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019465。
附图说明
[0025]图1：pCasAb/pSGAb双质粒系统结构说明；
[0026]图A.pCasAb质粒图谱；lacI基因：表达半乳糖诱导型启动子的阻遏蛋白；tac promoter：RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因表达的半乳糖诱导型启动子；beta和exo基因：
共同组成RecAb重组酶系统；rrnBT1T2：RecAb重组酶系统的终止子；sacB基因：用于后续质粒消除的
蔗糖敏感基因；aprR：大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中阿布拉霉素抗性基因片段；oriV、mobC、oriT、mobB、mobA、repB、repA、repC：共同组成革兰氏阴性菌广宿主复制子RSF1010；
[0027]图B.pSGAb质粒谱图；J23119：表达sgRNA的启动子；spacer：用于插入约20bp的靶点序列；rep(pMB1)：大肠杆菌中的质粒复制子；WH1266：鲍曼不动杆菌中的质粒复制子；kmR：大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中卡那霉素抗性基因片段；sacB基因：用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因；
[0028]附图2：pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中实现高效基因组编辑；[0029]图A.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因组编辑的步骤原理图；
[0030]图B.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因敲除的PCR验证、DNA测序和双氧水敏感实验结果；
[0031]图C.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因插入的转化平板图、PCR验证和DNA测序结果；
[0032]图D.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行单碱基突变的原理图和DNA测序结果。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0034]各实施例中使用的生物材料来源如下：
[0035]pCasKP-apr质粒(购自美国addgene公司，货号：117231)；
[0036]pSGKP-km质粒(购自美国addgene公司，货号：117233)；
[0037]pMMB67EH质粒(购自美国ATCC公司，货号：ATCC37622)；
[0038]pWH1266质粒(购自美国ATCC公司，货号：ATCC77092)；
[0039]pUC57-amilCP质粒(购自金唯智生物科技有限公司，全基因合成)
[0040]鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC17978)；
[0041]大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司，货号：DL1001)；
[0042]含有pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escheri
chia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019464。
[0043]含有pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019465。
[0044]各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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