(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011061446.7
(22)申请日 2020.09.30
(71)申请人 福建省农业科学院作物研究所
地址 350001 福建省福州市鼓楼区五四路
247号
(72)发明人 李国良 邱思鑫 张鸿 林赵淼
许泳清 许国春 李华伟 纪荣昌
刘中华 罗文彬 邱永祥 汤浩
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人 饶文君 蔡学俊
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了甘薯不同组织部位中稳定表
达内参基因及引物和应用，所述内参基因为
IbTUA；其中，所述内参基因IbTUA的核苷酸序列
如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明中甘薯稳
定表达的内参基因IbTUA是在不同类型甘薯的不
同组织部位最稳定的内参基因，该基因表达的稳
内参基因能为甘薯获得功能基因表达的精确定
量数据提供有力支持。权利要求书1页 说明书5页序列表6页 附图3页CN 112011642 A 2020.12.01
C N 112011642
A
1.一种甘薯内参基因TUA，其特征在于，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种扩增如权利要求1所述甘薯内参基因TUA的方法，其特征在于，以甘薯DNA 为模板，以如下引物对进行PCR 扩增；
正向引物：5'-ATGAGAGAGTGCATTTCAAT -3'，
反向引物：5'-TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG -3'。
3.一种如权利要求1所述甘薯内参基因TUA的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述实时荧光定量PCR引物序列如下：
正向引物：5'- TGTCCTGTCAACCCATTCC -3'，
反向引物：5'- TGAGGGCACCATCAAACC -3'。
权 利 要 求 书1/1页CN 112011642 A
一种甘薯内参基因TUA及引物和应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及不同类型甘薯的不同组织部位荧光定量内参基因及应用。
背景技术
[0002]甘薯在我国种植区域广泛，既可以作为粮食作物，也可以作为新型能源作物开发利用。据报道甘薯是世界卫生组织推荐的最佳蔬菜之一，富含类胡萝卜素、花青素、淀粉等多种营养物质。研究甘薯营养物质积累的分子机制是科学家们感兴趣的领域。
[0003]荧光实时定量PCR(RT-qPCR) 由于其敏感性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究，已有不同的科学家采用RT-qPCR技术研究了甘薯类胡萝卜素合成基因、花青素合成基因和淀粉合成基因的表达。然而，RT-qPCR结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。理想的内参基因应该在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参基因根本不存在。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获得准确的qRT-PCR 实验结果是非常重要的。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种甘薯不同组织稳定表达的内参基因，并揭露了利用该甘薯内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR 引物。
[0005]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种甘薯不同组织稳定表达的内参基因：所述
内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；且该内参基因是以甘薯DNA 为模板、并以如下引物对进行PCR 扩增反应所得的；
其中引物对为：
正向引物5'-ATGAGAGAGTGCATTTCAAT-3'，
反向引物5'-TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG-3'。
[0006]进一步地，以上述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件、并遵循实时荧光定量PCR 引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR 引物；
且该实时荧光定量PCR 引物为：
正向引物5'- TGTCCTGTCAACCCATTCC-3'，
反向引物5'- TGAGGGCACCATCAAACC-3'。
[0007]本发明的优点在于：
本发明提供了一种甘薯不同组织稳定表达内参基因TUA，同时揭露了利用该甘薯内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR 引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于甘薯不同组织部位基因表达分析时，稳定性高于已报道的甘薯内参基因，能够提高甘薯基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测甘薯组织表达的检测效率，并提高了检测结果的可
信度。
附图说明
[0008]图1为甘薯TUA基因的电泳图；
图2为候选内参基因电泳图；
图3为RT-qPCR中TUA的溶解曲线;
图4为geNorm 软件分析个候选内参基因的表达稳定值；
图5为geNorm软件分析甘薯中最佳的内参基因数量；
图6为NormFinder软件分析个候选内参基因的表达稳定值；
图7为BestKeeper软件分析个候选内参基因的表达稳定值。
具体实施方式
[0009]本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国ABI QuantStudio 5 实时荧光定量仪，美国ABI Veriti96-well 热循环仪，Nano Drop2000紫外分光光度计，DNA、RNA试剂盒，逆转录试剂盒，2×EasyTaq PCR SuperMix，实时荧光定量PCR试剂盒均购于北京全式金生物技术有限公司，其余生化试剂均为国产分析纯。
[0010]实施例1 内参基因TUA的获得
根据甘薯二倍体公布基因组数据库（jp/）设计一对引物，由福州博尚生物技术有限公司合成，该对引物(如SEQ ID NO：2、3所示) ：正向引物5'- ATGAGAGAGTGCATTTCAAT-3'，反向引物5'- TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG-3'。[0011]DNA提取：根据DNA提取试剂盒说明书EasyPure® Plant Genomic DNA Kit (含RNase A）(北京全式金生物技术有限公司，北京)，将甘薯叶片在液氮下研磨后，用试剂盒抽提，之后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA 质量，最后将DNA 稀释至50ng.L-1，并于-20℃冰箱中保存备用。
[0012]以甘薯DNA为模板，PCR扩增获得TUA基因组序列。PCR反应体系均为：2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，正反向引物(浓度为10μmol/L)各1μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 7μL，共计20 μL。PCR反应条件均为：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 30 s为1个循环，共经历30个循环；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃ 保存。最后通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
[0013]实施例2实时荧光定量PCR 设计和检测
以实施例1 获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件，并遵循实时荧光定量PCR 引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为185bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物(如SEQ ID NO ：4、5 所示)：正向引物5'- TGTCCTGTCAACCCATTCC-3'，反向引物5'-TGAGGGCACCATCAAACC-3'。
[0014]提取甘薯总RNA，并按照逆转录试剂盒TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京)的方法合成cDNA 第一链，即将RNA 反转录为cDNA ；之后以所得cDNA 为模板、以实时荧光定量PCR 引物为引物
对进行PCR 扩增，且PCR 扩增的反应体系与反应程序和实施例1相同，检测结果如图2 所示；由图2 可知，PCR 扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带(图2)，经测序大小为185bp，符合预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR 引物验证。
[0015]实施例3 内参基因稳定性验证
通过搜索甘薯18S rRNA rRNA、EF1α、eIF4α、GADPH、TIP41、TUA和TUB等基因的保守序列，根据qRT-PCR引物设计原则，设计出8种内参基因的目的片段引物。以及文献中的ARF、COX、GAP、RPL和UBI的引物对序列共12对，由福州博尚生物技术有限公司合成表1.候选内参基因的引物序列
ACT-F GTTATGGTTGGGATGGGACA
ACT-R GTGCCTCGGTAAGAAGGACA
ARF-F CTTTGCCAAGAAGGAGATGC
ARF-R TCTTGTCCTGACCACCAACA
COX-F ACTGGAACAGCCAGAGGAGA
COX-R ATGCAATCTTCCATGGGTTC
GAP-F ATACTGTGCACGGACAATGG
GAP-R TCAGCCCATGGAATCTCTTC
RPL-F TTTGACCGAAATGCCCTTAG
RPL-R TTCTGGTTCACCCCAACATT
UBI-F TCGACAATGTGAAGGCAAAG
UBI-R CTTGATCTTCTTCGGCTTGG
18S rRNA-F AGCAAGCCTACGCTCTGT
18S rRNA-R CTGGTCGGCATCGTTTAT
EF1α-F TGCCTTGTGGAAGTTTGA
EF1α-R GGAGTATTTGGGAGTGGTG
elF4A-F TACGAAACCCTTGCCATTA
elF4A-R ACACGGGAGGACCCAGAT
GADPH-F CTGTTTGGCGAGAAGTCA
GADPH-R GAGCAAGGCAGTTGGTAG
TIP41-F CTCAACTCCGCAAATCGT
TIP41-R GGAACTTCAACAGGTGGC
TUA-F TGTCCTGTCAACCCATTCC
TUA-R TGAGGGCACCATCAAACC
TUB-F CCCACGTCTTCATTTCTTC
TUB-R ATCCCACATTTGCTGAGTAG
本实验以合成的甘薯cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，荧光定量反应体系及程序参照说明书(北京全式金生物技术有限公司，北京)，反应体系为：2×TansSta rt TopGreen qPCR supermix(+Dye I) 10μL，正反向引物(浓度为10μmol/L)各0.4μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 7μL，共计20 μL。反应程序为：94 ℃ 预变性30 s；94 ℃ 5 s，60℃ 20s，72℃ 30s为1个循环，共经历40个循环。在ABI QuantStudio 5 Real-Time PCR System
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