(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911392203.9
(22)申请日 2019.12.30
(71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
院
申请人 得利斯集团有限公司
(72)发明人 张春晖 郭玉杰 李侠 王航
黄峰 郑乾坤
(74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理
事务所(普通合伙) 11369
代理人 卞静静
(51)Int.Cl.
C07K 14/78(2006.01)
C12P 21/06(2006.01)
C07K 1/14(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，包
括：步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用
功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；步
骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；步
骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行
盐析并收集蛋白沉淀；步骤四、将步骤三得到的
蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。
本发明还提供了Ⅱ型胶原蛋白的用途。相比于现
有技术，本发明的方法大幅度提升了Ⅱ型胶原蛋
白的纯度和产率，得到的Ⅱ型胶原蛋白结构完
整，并具有较好的热稳定性和高发泡性及乳化
性，在食品、医药、化妆品等行业具有良好的应用
前景。权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 111004320 A 2020.04.14
C N 111004320
A
1.Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括：
步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；
步骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；
步骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行盐析并收集蛋白沉淀；
步骤四、将步骤三得到的蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。
2.如权利要求1所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，在步骤一之前，还包括：步骤a、将软骨切碎，置入氯化钠溶液内，搅拌，洗去油脂和气泡；
步骤b、依次加入碳酸钠溶液、乙二胺四乙酸二钠溶液，并且间隔一段时间更换溶剂；步骤c、用蒸馏水洗涤步骤b得到的软骨，至洗涤后的蒸馏水的pH为7。 3.如权利要求1所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，加入醋酸溶液保持pH为2.
8。
4.如权利要求1所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，在冰浴中进行超声波处理，超声波的频率为20～25kHz，振幅为φ10。
5.如权利要求4所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，超声波处理采用脉冲模式，运行时间与暂停时间之比为2:3。
6.如权利要求5所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，运行时间包括第一运行时间和第二运行时间，第一运行时间与第二运行时间交替出现；
在第一运行时间内，超声波的频率为20kHz，功率为1000W，在第二运行时间内，超声波的频率为25kHz，功率为900W；
暂停时间包括第一暂停时间和第二暂停时间，第一暂停时间与第二暂停时间交替出现；
在第一暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物施加功率为900W的微波，在第二暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物内鼓入氮气。
7.如权利要求6所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，鸡胸软骨按1:6的质量体积比加入至0.5M的醋酸溶液中。
8.如权利要求7所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，加入氯化钠至氯化钠的浓度为5M。
9.利用如权利要求1～8的方法得到的Ⅱ型胶原蛋白的用途，其特征在于，用于制备发泡剂。
10.利用如权利要求1～8的方法得到的Ⅱ型胶原蛋白的用途，其特征在于，用于制备乳化剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 111004320 A
Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途
技术领域
[0001]本发明涉及胶原蛋白提取领域。更具体地说，本发明涉及一种Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途。
背景技术
[0002]软骨是肉品加工过程中的主要副产物，可以用作提取胶原蛋白的原料。但是，现有的提取方法产率较低，且得到的Ⅱ型胶原蛋白热稳定性较差，发泡性、乳化性等理化性质较弱，应用前景小。因此，亟需设计一种能够一定程度克服上述缺陷的提取方法。
发明内容
[0003]本发明的一个目的是提供一种Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途，相比于现有技术，本发明的方法大幅度提升了Ⅱ型胶原蛋白的纯度和产率，得到的Ⅱ型胶原蛋白可作为发泡剂和乳化剂用于食品、医药、化妆品的制备。
[0004]为了实现本发明的以上提到的目的及其它优点，本发明提供了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，包括：
[0005]步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；
[0006]步骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；
[0007]步骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行盐析并收集蛋白沉淀；[0008]步骤四、将步骤三得到的蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。[0009]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，在步骤一之前，还包括：
[0010]步骤a、将软骨切碎，置入氯化钠溶液内，搅拌，洗去油脂和气泡；
[0011]步骤b、依次加入碳酸钠溶液、乙二胺四醋酸二钠溶液，并且间隔一段时间更换溶剂；
[0012]步骤c、用蒸馏水洗涤步骤b得到的软骨，至洗涤后的蒸馏水的pH为7。
[0013]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，所述步骤一中，加入醋酸溶液保持pH 为2.8。
[0014]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，所述步骤一中，在冰浴中进行超声波处理，超声波的频率为20～25kHz，振幅为φ10。
[0015]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，超声波处理采用脉冲模式，运行时间与暂停时间之比为2:3。
[0016]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，
[0017]运行时间包括第一运行时间和第二运行时间，第一运行时间与第二运行时间交替出现；
[0018]在第一运行时间内，超声波的频率为20kHz，功率为1000W，在第二运行时间内，超声波的频率为25kHz，功率为900W；
[0019]暂停时间包括第一暂停时间和第二暂停时间，第一暂停时间与第二暂停时间交替出现；
[0020]在第一暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物施加功率为900W的微波，在第二暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物内鼓入氮气。
[0021]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，鸡胸软骨按1:6的质量体积比加入至0.5M的醋酸溶液中。
[0022]优选的是，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，加入氯化钠至氯化钠的浓度为5M。[0023]本发明还提供了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法的用途，用于制备发泡剂。
[0024]本发明还提供了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法的用途，用于制备乳化剂。
[0025]本发明至少包括以下有益效果：
[0026]本发明的提取方法相比于现有技术，产率和纯度更高，得到的Ⅱ型胶原蛋白热稳定性更高、持水性更好、吸油性更强，并且具有作为发泡剂、乳化剂的应用前景。
[0027]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0028]图1为非超声处理和超声处理的鸡胸骨软骨中Ⅱ型胶原蛋白的提取方法流程图；[0029]图2为本发明的的基于湿重、干重和蛋白质重量计算的II型胶原蛋白产率；[0030]图3为本发明的II型胶原蛋白的紫外吸收光谱；
[0031]图4为本发明II型胶原蛋白的圆二谱；
[0032]图5为本发明II型胶原蛋白的傅里叶变换红外光谱；
[0033]图6为本发明II型胶原蛋白的差示扫描量热法的测定结果；
[0034]图7为本发明II型胶原蛋白的微观结构；
[0035]图8为超声处理时间对(A)发泡能力(FA)、(B)发泡稳定性(FS)的影响对比图；[0036]图9为超声处理时间对(A)乳化活性指数(EAI)、(B)乳化稳定性指数(ESI)的影响对比图。
具体实施方式
[0037]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0038]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0039]本发明提供了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，包括：
[0040]步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；
[0041]步骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；
[0042]步骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行盐析并收集蛋白沉淀；[0043]步骤四、将步骤三得到的蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。[0044]本技术方案中超声波功率优选为950W，超声波处理优选时间为36分钟，离心优选
采用电磁搅拌器，离心时间优选至少1小时，离心条件优选为13000g。优选采用氢氧化钠溶液将上清液的pH调节为7。后续采用常规盐析法析出Ⅱ型胶原蛋白。沉淀优选用0.1M的醋酸溶解。优选在4℃下透析。本技术方案通过超声波处理过程，能够提升产率和Ⅱ型胶原蛋白的理化性能。
[0045]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，在步骤一之前，还包括：[0046]步骤a、将软骨切碎，置入氯化钠溶液内，搅拌，洗去油脂和气泡；
[0047]步骤b、依次加入碳酸钠溶液、乙二胺四醋酸二钠溶液，并且间隔一段时间更换溶剂；
[0048]步骤c、用蒸馏水洗涤步骤b得到的软骨，至洗涤后的蒸馏水的pH为7。该技术方案为预处理步骤，优选地，采用20％(w/v)的NaCl溶液，按1:10(w/v)的比例加入0.5M Na2CO3除去素，按1:10(w/v)的比例加入0.3M EDTA-Na2，保持24h除去鸡胸软骨中的矿物质离子。[0049]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，所述步骤一中，加入醋酸溶液保持pH为2.8。
[0050]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，所述步骤一中，在冰浴中进行超声波处理，超声波的频率为20～25kHz，振幅为φ10。
[0051]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，超声波处理采用脉冲模式，运行时间与暂停时间之比为2:3。
[0052]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，
[0053]运行时间包括第一运行时间和第二运行时间，第一运行时间与第二运行时间交替出现；
[0054]在第一运行时间内，超声波的频率为20kHz，功率为1000W，在第二运行时间内，超声波的频率为25kHz，功率为900W；
[0055]暂停时间包括第一暂停时间和第二暂停时间，第一暂停时间与第二暂停时间交替出现；
[0056]在第一暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物施加功率为900W的微波，在第二暂停时间内，向软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液的混合物内鼓入氮气。
[0057]本技术方案在脉冲模式的超声波处理的基础上进一步改进，即在两种运行时间内，分别施加低频率、高功率的超声波和高频率、低功率的超声波，在两种暂停时间内，分别施加微波和鼓入氮气。本技术方案能够增强脉冲模式的超声波处理过程，进一步提升产率和Ⅱ型胶原蛋白的理化性能。
[0058]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，鸡胸软骨按1:6的质量体积比加入至0.5M的醋酸溶液中。
[0059]在另一种技术方案中，所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，加入氯化钠至氯化钠的浓度为5M。
[0060]本发明还提供了基于该提取方法获得的Ⅱ型胶原蛋白的用途，用于制备发泡剂。[0061]本发明还提供了基于该提取方法获得的Ⅱ型胶原蛋白的用途，用于制备乳化剂。[0062]以下以鸡胸软骨为例具体说明本发明的提取方法，并与现有技术(本文称为“非超声处理)进行对比。
[0063]1、原材料和化学试剂：
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