[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101204577A [43]公开日2008年6月25日
[21]申请号200610167770.0[22]申请日2006.12.21
[21]申请号200610167770.0
[71]申请人中国人民解放军军事医学科学院微
生物流行病研究所
地址100071北京市丰台区东大街20号
共同申请人北京民海生物科技有限公司
[72]发明人王景林 刘建凯 郑海发 高姗 谢亮 康
琳 张小伶 廖丹 [51]Int.CI.A61K 38/16 (2006.01)C12N 1/20 (2006.01)C12P 21/02 (2006.01)
A61P 21/00 (2006.01)
C12R 1/145 (2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 7 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及一种A型肉毒毒素结晶复合物的制
备方法，所得制品为生物医药用品，主要用于面部
肌肉肌张力障碍、斜视、眼睑痉挛和除皱美容
等多种临床适应症。其工艺为：产毒培养—肉毒梭
核酸酶处理—Sephacryl－200凝胶过滤—DEAE－Se
pharose—硫酸盐透析并自然形成结晶—毒素稀释、
冻干。利用本发明较以前技术具有耗时少，成本低，
操作简便的特点，获得制品质量好，纯度高等优点。
200610167770.0权 利 要 求 书第1/3页 1.一种A型B o N T结晶复合物的制备方法，包括如下步骤：将产生A型BoNT的菌株经过由酶水解酪素，酵母浸粉，硫代乙醇酸钠，半胱氨酸盐酸盐，葡萄糖和水组成的培养基培养，然后通过包括酸沉淀、磷酸盐抽提、核酸酶处理、硫酸铵沉淀的粗提纯，包括凝胶过滤层析、阴离子交换层析的精提纯，然后结晶后得到A型BoNT结晶复合物。
2.根据权利要求1的A型B o N T结晶复合物的制备方法，其中产生A型BoNT的菌株为HallA-hyper、62A或NCTC291。
3.根据权利要求1或2的A型BoNT结晶复合物的制备方法，其中所用产生A型BoNT的菌株为62A。
4.根据权利要求1所述方法，其中培养基成分为：
酶水解酪素 1～10％
酵母浸粉 1～10％
硫代乙醇酸钠 0.01-0.05％
半胱氨酸盐酸盐0.01-0.1％
葡萄糖 0.1～2％
其余为水。
5.根据权利要求1或4所述方法，其中培养基成分为：
酶水解酪素 1～3％
酵母浸粉 1～3％
硫代乙醇酸钠 0.01-0.025％
半胱氨酸盐酸盐0.01-0.05％
葡萄糖 0.1～1％
其余为水。
6.权利要求1所述方法中产生A型BoNT的菌株的培养步骤为：将进行适应性培养的A型肉毒梭菌菌种，按一定比例接种于产毒液体培养基中，30-37℃培养，然后用微孔滤膜过滤除菌，用小白鼠测毒力，特异性毒力应在105 LD50/ml以上。
7.权利要求1所述方法中毒素的粗提纯方法，包括如下步骤： (1)酸沉淀与提取：用3N硫酸溶液将产毒液体培养基pH调至3.2-4.2，室温静置过夜，去上清，用灭菌水洗沉淀两次，用0.2 M pH 6.0磷酸盐缓冲液充分悬起毒素沉淀物，在室温下轻微搅拌1-3小时，剩余沉淀将重复上述步骤并收集上清，合并两次上清，
(2)硫酸铵沉淀与去除核酸：冰浴中缓慢加入硫酸铵至60％饱和，4℃过夜，收集沉淀，0.05 M pH 6.0磷
酸盐缓冲液充分溶解沉淀，加入核糖核酸酶(50-100μg/m L)在30℃～34℃下作用3～5小时，收集上清，其中，加入60％硫酸铵，沉淀析出后，离心收集沉淀，用0.05 M pH 5.2-5.8醋酸钠或柠檬酸缓冲溶液溶解沉淀，离心去沉淀
8.权利要求1所述方法中毒素的精提纯方法，包括如下步骤：
(1)粗提纯毒素上清液进行凝胶过滤层析；
(2)选择凝胶的范围为：能有效分离蛋白分子量3×105以下的凝胶；
(3)用pH 5.2-5.8的0.05 M醋酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲溶液作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一个样品峰；
(4)将凝胶过滤后的样品进行阴离子交换层析，用pH 5.2-5.8的0.05M醋酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲溶液进行洗脱，收集第一个样品峰。
9.根据权利要求8所述方法，其中选择凝胶的范围为能有效分离蛋白分子量2.5×105以下的凝胶。
10.根据权利要求8所述方法，其中选择凝胶的范围为Sephacryl-200。
11.根据权利要求8所述方法，其中阴离子交换层析所用凝胶为阴离子交换树脂。
12.根据权利要求8所述方法，其中阴离子交换层析所用凝胶为DEAE-Sepharose。
13.根据权利要求1所述方法，其中结晶包括如下步骤：以磷酸盐缓冲液将收集到的毒素样品浓度调至6-8mg/ml，加入硫酸铵至终浓度为0.9 M，4℃静置待结晶形成。
200610167770.0说 明 书第1/7页
一种A型肉毒毒素结晶复合物的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物毒素制备方法，具体涉及一种细菌毒素结晶复合物的制
备方法。
背景技术
肉毒神经毒素(b o t u l i n u m n e u r o t o x i n，B o N T)，也称肉毒毒素(b o t u l i n u m t o x i n)，是厌氧肉毒梭状芽孢杆菌，即肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中产
生的一种外毒素，属于蛋白类神经毒素。A型BoNT是目前自然界中已知毒性
最强的生物毒素，小鼠腹腔LD50仅有0.001μg/kg。它能作用于运动神经末梢肌
肉接点，抑制突触前膜释放乙酰胆碱，从而引发肌肉松弛性麻痹。
世界上对BoNT的研究，以A型为早、为多、也了解得最清楚，最早应用
于临床。1946年，美国Schantz博士和他的同事首次通过培养A型肉毒梭
菌大量提纯制备了结晶状的A型BoNT(Schantz 1994；Schantz & Johnson 1997)。随
后Duff等人进行了纯化方法的改进(Duff et al.，1957)。这些工作成为后来制备
A型BoNT结晶复合物的重要基础。50年代末，Brooks博士发现，注射BoNT
可封闭活动亢进肌肉神经模梢乙酰胆碱的释放，呈暂时性麻痹，这个发现激发
了作为潜在药物研究的兴趣。
20世纪60年代后期，美国眼科医生Scott与Schantz博士合作通过猴子的
试验证明A型BoNT有助于斜视的矫正，并试用于斜视病人(Scott 1980)。1978
年，Schantz制备的A型BoNT通过了美国食品药品管理局(FDA)的批准进
入临床试验研究。在经过7000多例斜视患者的成功，以及大量试验研究和
临床应用的基础上，1989年12月美国FDA正式批准A型BoNT制剂为新药，
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