[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101487019A
[43]公开日2009年7月22日
[21]申请号200810073012.1[22]申请日2008.11.27
[21]申请号200810073012.1
[71]申请人新疆农业科学院微生物应用研究所
地址830091新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市南昌
路403号新疆农科院
[72]发明人王炜 包慧芳 崔卫东 詹发强 杨红兰 [51]Int.CI.C12N 15/81 (2006.01)C12N 15/56 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种工业微生物－产朊假丝酵母
的表达载体，本发明还同时提供了产朊假丝酵母表
达载体的构建方法。本发明通过以pBR322载体作为
用定点突变法获得抗性基因，同样以产朊
假丝酵母基因组DNA为模板，采用PCR方法获得其rD
NA片段和GAP启动子－终止子片段，构建以18S rDN
A 介导的具有抗性的产朊假丝酵母整合型
表达载体，用于产朊假丝酵母表达外源蛋白，广泛
应用于饲料添加剂、食品工业及制药业等领域。
200810073012.1权 利 要 求 书第1/1页 1、一种产朊假丝酵母整合型表达载体，其特征在于，以pBR322为基本骨架，以(CYH)为抗性基因，以18S rDNA片段为介导序列，以GAP启动子-终止子为启动子-终止子，携带外源基因在产朊假丝酵母中进行表达中获得。
2、如权利要求1所述的产朊假丝酵母表达载体构建方法，其特征在于，所述的表达载体构建方法具体操作如下：
(1)对产朊假丝酵母L41基因序列进行分析，设计两对引物，采用套叠PCR 方法对产朊假丝酵母L41基因第56位氨基酸序列进行定点突变，获得抗性基因；
(2)以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，扩增出所需的产朊假丝酵母18S rDNA片段；
(3)产朊假丝酵母中的GAP启动子是一种很强的组成型启动子，根据其GAP 启动子-终止子序列设计两对引物，分别扩增出GAP启动子、终止子片段，并通过设计合适的酶切位点在启动子终止子之间引入多克隆位点；
(4)以pBR322为产朊假丝酵母表达载体改造的骨架，将克隆好的抗性基因、rDNA片段、GAP启动子-多克隆位点-终止子片段构建至pBR322相应位置，得到产朊假丝酵母表达载体。
3、一种以木聚糖酶基因为目的基因构建的产朊假丝酵母表达载体，其特征在于，将木聚糖酶基因插入权利要求1所述的载体，采用电击法转化产朊假丝酵母，将木聚糖酶基因在产朊假丝酵母中的表达中获得的重组表达载体。
200810073012.1说 明 书第1/8页
一种产朊假丝酵母表达载体及其构建方法
发明领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及产朊假丝酵母一种转化系统的建立，用于表达外源蛋白的技术领域。
背景技术
大肠杆菌E.coli表达系统是目前为止最为有效和方便的表达系统，但外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内。E.coli 作为表达宿主，无法进行特定的翻译后修饰，特别是对真核基因的表达，可能导致产物失去生物活性。为了克服大肠杆菌表达系统的不足，需要发展新的真核表达系统。酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。
产朊假丝酵母是一种极重要的工业微生物，常被用于生产多种有用的生物物质，如谷胱甘肽及一些氨基酸和酶类。它和啤酒酵母、克鲁维酵母被美国食品与药品安全管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证为可作为食品添加剂的酵母，能运用于食品、制药业以及畜禽的饲料中。目前使用较多的酿酒酵母和甲醇酵母与产朊假丝酵母相比均存在着不同的缺陷，如大量表达时酿酒酵母常常会发生质粒丢失
的现象，且重组蛋白常发生超糖基化；在有些实验中，分泌性的蛋白滞留于壁膜间隙中，使分离纯化十分困难，而且在发酵中通常有乙醇的产生，难以对其进行高密度发酵。现阶段广泛使用的甲醇酵母，
如毕赤酵母、汉逊酵母表达系统，尽管具有高表达、高稳定、高分泌的特点，但它们不是食品酵母，在诱导中需要添加甲醇，在部分行业不能被广泛接受。另外，产朊假丝酵母本身还具有一些特点：①不具有酵解抑制有氧氧化效应(crabtree-negative)，因而在严格好气的条件下生长不会产生乙醇；②产朊假丝酵母属多倍体，而且其基因组中rDNA属高度重复单元，使用此重复序列作为整合载体同源重组位点可使外源基因与宿主染体之间发生多拷贝同源重组；③发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可达到92g/L；④在廉价的糖蜜中就能生长；⑤作为添加剂可直接使用，无需进行酶制剂的发酵生产和添加。因而产朊假丝酵母作为基因工程表达宿主具有很大的潜力。
目前产朊假丝酵母表达载体尚未商品化，探索一条可行的产朊假丝酵母表达载体构建方法或构建出商品化的产朊假丝酵母表达载体将具有重要的意义。发明内容
针对目前产朊假丝酵母是多倍体无有性世代，难于获得营养缺陷型宿主用于构建转化系统，这给产朊假丝酵母转化体系的建立带来很大障碍的现状，已报道没有可行的商品化的产朊假丝酵母表达载体。本发明提供了一种产朊假丝酵母表达载体及其构建方法。
本发明构建出了一种通用的产朊假丝酵母表达载体，并提供了一条可行的产朊假丝酵母表达载体构建方
法。
本发明以pBR322载体作为基本骨架，以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，采用定点突变法获得抗性基因，同样以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，采用P C R方法获得其r D N A片段和G A P启动子-终止子片段，构建具有抗性的产朊假丝酵母表达载体。并以木聚糖酶基因为目的基因，构建重组
表达载体，采用电击法转化产朊假丝酵母。对转化后的产朊假丝酵母进行酶活测定，以此来检测产朊假丝酵母表达载体是否构建成功及外源基因能否在产朊假丝酵母中成功表达。具体操作如下：
(1)采用相关数据库对产朊假丝酵母L41基因序列进行分析，设计两对引物，采用套叠PCR方法对产朊假丝酵母L41基因第56位氨基酸序列进行定点突变，获得抗性基因。
(2)以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，扩增出所需的产朊假丝酵母rDNA。
(3)产朊假丝酵母中的3-磷酸甘油醛(GAP)启动子是一种很强的组成型启动子，根据GAP启动子-终止子序列设计两对引物，分别扩增出GAP启动子、终止子片段，并通过设计合适的酶切位点在启动子终止子之间引入多克隆位点。
(4)以p B R322为产朊假丝酵母表达载体改造的骨架，将克隆好的抗性基因、rDNA片段、GAP
启动子-多克隆位点-终止子片段构建至pBR322相应位置，即得到产朊假丝酵母表达载体。
本发明通过将重组质粒线性化，采用电击法转化产朊假丝酵母，用抗性平板筛选转化子，并采用逐步提高抗性浓度以及PCR的方法进行进一步筛选和鉴定。
挑选阳性转化子进行发酵培养，分别收集菌体和发酵液，对发酵液和超声波破碎后的菌体采用还原糖法对表达产物进行酶活测定。同时，对发酵液和超声波破碎后的菌体进行SDS-PAGE分析。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，达到以下有益效果。 本发明通过提供一种产朊假丝酵母整合表达载体及其构建方法，为探索一条可行的产朊假丝酵母表达载体构建方法或构建出商品化的产朊假丝酵母表达
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