DNA测序仪
DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国pe abi 公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 原理
abi prism 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四荧光染料标记的ddntp(标记终止物法),因此通过单引物pcr测序反应,生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序pcr产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检 测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜的荧光,并在ccd摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA 测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的ccd摄影机检测器,使DNA 测序缩短至2.5h,pcr片段大小分析和定量分析为10~40min。
由于该仪器具有DNA测序,pcr片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
试剂与器材
1.bigdye测序反应试剂盒主要试剂是bigdye mix,内含pe专利四荧光标记的ddntp 和普通dntp,amplitaq DNA polymerase fs,反应缓冲液等。
2.pgem-3zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/l,试剂盒配套试剂。
3.m13(-21)引物tgtaaaacgacggccagt,3.2μmol/l,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。
4.DNA测序模板可以是pcr产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在pcr 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/l,即200ng/μl。
5.引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成 3.2μmol/l,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如m13(-21)引物,t7引物等。
6.灭菌去离子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的pcr管盖体分离,pe公司产品。
8.3mol/l 醋酸钠(ph5.2) 称取40.8g naac?3h2o溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调ph至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。
9.70%乙醇和无水乙醇。
10.naac/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混匀,室温可保存1年。
11.pop 6测序胶abi产品。
12.模板抑制试剂(tsr) abi产品。
13.10×电泳缓冲液abi产品。
14.abi prism 310型全自动DNA测序仪。
15.2400型或9600型pcr仪。
16.台式冷冻高速离心机。
17.台式高速离心机或袖珍离心机。
操作步骤
pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管bigdye mix 1μl 1μl 待测的质粒DNA 1μl -pgem-3zf (+) 双链DNA -1μl 待测DNA的正向引物1μl -m13(-21)引物-1μl 灭菌去离子水2μl 2μl 总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧pcr管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环,pcr 循环参数为96℃10s,50℃5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min 于4℃离心30 min,小心弃上清。
(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。
电泳前测序pcr产物的处理。
(1) 加入12μl的tsr于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中,稍离心。
(3) 在pcr仪上进行热变性(95℃2min),冰中骤冷,待上机。
分析或打印出彩测序图谱
上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kv预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kv,20min),在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩测序图谱。
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