(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811122909.9
(22)申请日 2018.09.26
(71)申请人 北京市农林科学院
地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路9
号北京市农林科学院玉米研究中心
(72)发明人 杨进孝 杨永星 吕欣欣 赵思
冯峰
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅 秦梦楠
(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
C12N 9/22(2006.01)
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明公开了切刻酶及其在基因组碱基替
换中的应用。本发明首次将切刻酶HypaCas9n与
HypaCas9n&PmCDA1&UGI与SpCas9n&PmCDA1&UGI
相比，在基本不影响C ·T碱基替换效率的情况
下，
脱靶效率能够降低。权利要求书1页 说明书6页序列表20页 附图1页CN 109265562 A 2019.01.25 C N 109265562
A
1.融合蛋白，由切刻酶、胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI组成；所述切刻酶如序列表的序列13自N端第1-1423位氨基酸所示。
2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因。
3.一种碱基编辑系统，包括权利要求1所述的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的碱基编辑系统，其特征在于：所述系统还包括sgRNA。
5.表达权利要求3或4所述的碱基编辑系统的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌。 6.一种用于基因组碱基替换的重组表达载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲表达权利要求1所述的融合蛋白；所述表达盒乙包括n个元件乙；所述元件乙包括sgRNA和靶序列；所述重组表达载体可靶向n个不同的靶序列进行碱基替换。
7.一种植物基因组碱基替换的方法，包括如下步骤：利用权利要求3或4所述的碱基编辑系统完成植物基因组碱基替换。
8.一种植物基因组碱基替换的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述的重组表达载体导入目的植物，实现植物基因组碱基替换。
9.切刻酶，如序列表的序列13自N端第1-1423位氨基酸所示。
10.权利要求1所述的融合蛋白，或，权利要求3或4所述的碱基编辑系统，或，权利要求5所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌，或，权利要求6所述的重组表达载体，或，权利要求9所述的切刻酶，在植物基因组碱基替换中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 109265562 A
一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用。
背景技术
[0002]CRISPR-Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associatedprotein 9)技术的出现和发展，已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein–RNA复合物通过向导RNA (guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(DSB，dsDNAbreak)，而后，生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。一般有两种修复机制，一种是非同源末端连接(NHEJ，non-homologous endjoining)，一种是同源重组(HDR，homology-directed repair)，通常情况下，NHEJ修复占大多数，因此，修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。
[0003]2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(CBE，cytosine base editor)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶实现直接对单个的C(胞嘧啶，Cytosine)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为T(胸腺嘧啶，Thymine)的碱基编辑效率。PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)就是其中使用的一种胞苷脱氨酶。在所测试的PmCDA1编辑器中，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI(尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，uracil DNA glycosylase inhibitor)碱基编辑系统的平均突变率较高，一是因为UGI可以抑制UDG(尿嘧啶DNA糖化酶，uracil DNAglycosylase)催化清除DNA中U(尿嘧啶，Uracil)，二是因为SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repai
r)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。SpCas9n (D10A)连带着PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成U，通过DNA的修复使得U与A(腺嘌呤，Adenine)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。
[0004]植物中使用SpCas9进行基因组编辑时具有一定的脱靶效应，SpCas9n(D10A)与PmCDA1融合使用进行碱基编辑，即使用SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑系统时可能存在潜在的脱靶风险。虽然植物不同于动物，在后代可以通过遗传分离去除脱靶位点，但是由于一些潜在的脱靶位点可能是未知的，所以，后代中就很难有目的性的去除。因此，降低脱靶效应也是植物中一直以来的技术方向。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用。
[0006]本发明首先提供了融合蛋白，由切刻酶、胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI组成；所述切刻酶如序列表的序列13自N端第1-1423位氨基酸所示。
[0007]所述胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1如序列表的序列13自N端第1521-1728位氨基酸所示。
[0008]所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI如序列表的序列13自N端第1736-1833位氨基酸所示。
[0009]本发明还保护所述融合蛋白的编码基因。
[0010]所述融合蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2自5’端第1721-7222位所示(其中，第1721-5989位为切刻酶的编码基因，第6281-6904位为胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1的编码基因，第6926-7222位为尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI的编码基因)。
[0011]本发明还保护一种碱基编辑系统，包括所述融合蛋白。
[0012]所述系统还包括sgRNA。
[0013]所述sgRNA的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第571-646所示。
[0014]本发明还保护表达所述碱基编辑系统的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌。表达所述融合蛋白的表达盒具体可为表达盒甲。表达所述sgRNA的表达盒具体可为表达盒乙。
[0015]本发明还保护一种用于基因组碱基替换的重组表达载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲表达所述融合蛋白；所述表达盒乙包括n个元件乙；所述元件乙包括sgRNA 和靶序列；所述重组表达载体可靶向n个不同的靶序列进行碱基替换。
[0016]所述sgRNA的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第571-646所示。
[0017]所述元件乙还包括pre-tRNA。所述pre-tRNA的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第第474-550位所示。所述元件乙自5’端依次为pre-tRNA、靶点序列和sgRNA的核苷酸序列。
[0018]以上任一所述表达盒甲由启动子甲启动切刻酶的编码基因、胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1的编码基因和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI的编码基因表达。所述表达盒甲自5’端依次包括启动子甲、切刻酶的编码基因、胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1的编码基因、尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI的编码基因和终止子甲。所述启动子甲具体可为OsUbq3启动子。所述OsUbq3启动子的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第1-1714位所示。所述终止子甲具体可为CaMV35S终止子。所述CaMV35S终止子的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第7229-7423位所示。所述切刻酶的编码基因如序列表的序列2自5’端第1721-5989位所示。所述胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1的编码基因如序列表的序列2自5’端第6281-6904位所示。所述尿嘧啶DNA 糖化酶抑制剂UGI编码基因如序列表的序列2自5’端第6926-7222位所示。所述表达盒甲具体可如序列表的序列2所示。
[0019]以上任一所述表达盒乙由启动子乙启动元件乙表达。所述表达盒乙自5’端依次为启动子乙、元件乙和终止子乙。所述启动子乙具体可为OsU3启动子。所述OsU3启动子的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第131-467位所示。所述终止子乙具体可为OsU3终止子。所述OsU3终止子的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第993-1283位所示。当靶序列如表1所示时，所述表达盒乙具体可如序列表的序列1自5’端第131位-1283位所示。
[0020]当靶序列如表1所示时，以上任一所述重组表达载体具体可为将序列表的序列1自5’端第1290-8712替换为序列表的序列2得到的环状质粒。
[0021]本发明还保护一种植物基因组碱基替换的方法，包括如下步骤：利用以上任一所
述的碱基编辑系统完成植物基因组碱基替换。
[0022]本发明还保护一种植物基因组碱基替换的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组表达载体导入目的植物，实现植物基因组碱基替换。
[0023]本发明还保护切刻酶，如序列表的序列13自N端第1-1423位氨基酸所示。[0024]本发明还保护所述融合蛋白，或，所述碱基编辑系统，或，以上任一所述重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌，或，所述切刻酶在植物基因组碱基替换中的应用。[0025]以上任一所述碱基替换为将碱基C替换为T。
[0026]以上任一所述所述植物具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。
[0027]本发明首次将切刻酶HypaCas9n与PmCDA1和UGI融合构建了碱基编辑系统，发现HypaCas9n&PmCDA1&UGI与SpCas9n&PmCDA1&UGI相比，在基本不影响C·T碱基替换效率的情况下，脱靶效率能够降低。
附图说明
[0028]图1为SpCas9n&PmCDA1&UGI与HypaCas9n&PmCDA1&UGI的C·T碱基替换效率。[0029]图2为SpCas9n&PmCDA1&UGI与HypaCas9n&PmCDA1&UGI的脱靶效率。
具体实施方式
[0030]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0031]日本晴水稻：参考文献：梁卫红，王高华，杜京尧，等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017 (2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。
[0032]下述实施例中靶标基因、靶点名称和序列如表1所示。
[0033]表1
[0034]
靶标基因靶点名称靶点序列
OsALS CS650cgcgtccatggagatccacc
OsCDC48CS651gaccagccagcgtctggcgc
OsNRT1.1B CS652cggcgacggcgagcaagtgg
[0035]实施例1、HypaCas9n&PmCDA1&UGI系统C·T碱基替换效率
[0036]一、基因组编辑载体的构建
[0037]1、SpCas9n&PmCDA1&UGI载体：人工合成序列表的序列1所示的环状质粒。[0038]序列表的序列1包括如下三个表达盒：
[0039]序列1自5’端第131位-1283位为表达盒I，其中，第131-467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474-550位为pre-tRNA的核苷酸序列，第551-570位为CS650靶点的核苷酸序列，第571-646位为sgRNA的核苷酸序列，第647-723位为pre-tRNA的核苷酸序列，第724-743位为CS651靶点的核苷酸序列，第744-819位为sgRNA的核苷酸序列，第820-896位为pre-tRNA 的核苷酸序列，第897-916位为CS652靶点的核苷酸序列，第917-992位为sgRNA的核苷酸序
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