李潇;张晓娥;卢永波;金岩
【摘 要】概述了3D皮肤模型在化妆品功效评价中的应用,对3D皮肤模型的类型以及基于各种3D皮肤模型的主要体外功效检测方法进行了介绍.3D表皮模型由角质形成细胞构成,用于皮肤屏障、保湿、抗炎、UV防护、经皮吸收等功效性检测;3D黑素皮肤模型由角质形成细胞和黑素细胞构成,主要用于美白功效检测;3D全层皮肤模型由角质形成细胞和成纤维细胞构成,主要用于抗衰功效检测.基于3D皮肤模型,可获得多维度检测结果,实现对化妆品受试物功效的综合评价. 【期刊名称】《日用化学工业》
【年(卷),期】2018(048)009
【总页数】7页(P489-494,510)
【关键词】化妆品功效评价;3D皮肤模型;体外检测;皮肤屏障;美白;抗衰
【作 者】李潇;张晓娥;卢永波;金岩
【作者单位】广东博溪生物科技有限公司 陕西分公司,陕西 西安 710048;广东博溪生物科技有限公司 陕西分公司,陕西 西安 710048;广东博溪生物科技有限公司 陕西分公司,陕西 西安 710048;第四军医大学 组织工程研发中心,陕西 西安 710032
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ658
体外科学检测的理念源于William M.S.Russell和Rex Burch在1959年出版的《The Principle of Humane Experimental Technique》一书，两位科学家提出了3R理念，即减少(Reduction)、优化(Refinement)、代替(Replacement)[1]。这一理念推动了3D皮肤模型，以及基于3D皮肤模型的体外科学检测方法的发展。虽然早期的应用以化妆品安全性检测为主，但随着功效化妆品、药妆品等产业的发展，3D皮肤模型正被广泛地应用于化妆品功效研究与评价，成为支撑化妆品创新的关键技术体系。
1 3D皮肤模型的构建技术
化妆品功效性检测模型的关键是在体外模拟出人体皮肤组织对受试物质的功效性响应。体外
测试模型根据不同的检测指标及检测方法的要求可以分为细胞水平、组织水平、器官水平以及系统水平，整合了细胞培养技术、生物反应器、人体组织器官构建、自动化控制、微流控等技术优势，以实现从简单到复杂的体外测试模型的建立[2-4]。
3D皮肤模型构建技术的基本原理是从机体获取少量的活体皮肤组织，将细胞从组织中分离，并在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与生物材料按照一定的比例混合，使细胞粘附、生长于生物材料上形成3D皮肤模型[3,4]。在3D皮肤模型的构建过程中，皮肤的结构、力学强度、基质成分以及功能基因的表达都能得到一定的控制。因此，3D皮肤模型具备结构和生理代谢上与人体皮肤的一致性，可实现化妆品原料及配方的体外科学检测。
3D皮肤模型构建技术的核心在于发育及形态发生过程的精确调控。独立培养的角质形成细胞，或与体外构建的真皮替代物复合之后，升至气/液面以促进表皮的分化和成熟。这种培养模式使得皮肤组织可以与培养液接触从而获得足够的营养，同时与空气接触的角质形成细胞逐渐成熟与角化。
角质形成细胞和成纤维细胞在皮肤构建过程中可以分泌多种细胞因子，包括生长因子、细胞外基质聚合体以及一些代谢分解的酶。上皮细胞和间质细胞的复合会诱导2种细胞间的旁分
泌机制，例如角质形成细胞分泌的PDGF，TGF-β和bFGF等因子，以及成纤维细胞分泌的IGFs等因子。研究表明，3D皮肤模型中的细胞可以持续分泌生长因子，从而在模型发育、成熟的过程中发挥积极的作用。
2 3D皮肤模型的主要类型
2.1 3D表皮模型
自1979年首例含有功能性表皮层的皮肤模型构建以来，已经有多款皮肤模型在体外构建成功[5]：其中包括法国的EpiSkin、SkinEthic RHE，美国的EpiDerm，德国的epiCS，日本的LabCyte EPI-MODEL，以及中国的EpiKutis。但由于细胞来源、构建技术、配方成分的差异，使构建的组织工程皮肤的精细结构不尽相同，尤其是角质层的结构和角质层脂质组分与正常皮肤相比还有较大的差异[6]。
3D表皮模型EpiKutis采用中国人角质形成细胞，经组织工程专利技术培养而成，是目前国内首款实现产业化生产的皮肤测试模型。EpiKutis的结构和人体正常皮肤结构高度相似(见图1)，是皮肤生物学研究和化妆品体外功效性评价的有效工具。
图1 3D表皮模型EpiKutis的组织学结构Fig.1 The histology of 3D reconstructed epidermis model,EpiKutis
2.2 3D黑素皮肤模型
目前已有多款3D黑素皮肤模型在体外构建成功：其中包括法国的SkinEthic RHPE、美国的MelanoDerm、德国的epiCS-M以及中国的MelaKutis。通常含有5%～10%不等比例的黑素细胞，其生长于3D黑素皮肤模型的基底层，随角质形成细胞复层化形成表皮结构[7,8]。目前，通过从活检皮肤组织中分离黑素细胞，在体外已经可以构建多种3D素皮肤模型。和人体皮肤一致的是，采用黑种人来源细胞构建的皮肤模型同白种人的相比，具有十分高的黑素合成速度，而黄种人则居中。
2.3 3D全层皮肤模型
目前已有多款3D全层皮肤模型在体外构建成功：其中包括法国的T-Skin、美国的EpiDerm FT、德国的Phenion FT以及中国的FulKutis[9]。通常含有成纤维细胞构成的真皮层以及复合其上的表皮层。目前，通过从活检皮肤组织中分离的成纤维细胞，在体外可由胶原、壳聚糖
凝胶、高分子支架材料以及无ECM体系构建形成真皮结构，并与角质形成细胞进行复合培养形成全层结构。和人体皮肤一致的是，全层皮肤模型具备充分的真表皮细胞相互作用。
3 3D皮肤模型在化妆品功效评价中的应用
3.1 3D表皮模型在化妆品功效检测中的应用
3D表皮模型一般用于安全性检测，包括皮肤腐蚀性、皮肤刺激性、皮肤光毒性、遗传毒性等；也可用于功效性检测，包括皮肤屏障、保湿、抗炎、UV防护、经皮吸收等。基于3D表皮模型的功效检测可以整合基因水平、蛋白水平与组织水平的多维度数据，实现综合的功效评估。
3.1.1 3D表皮模型在化妆品促屏障功效评价中的应用
皮肤屏障在皮肤抵御外环境、维持内稳态、防止皮肤水分散失等方面发挥重要作用。皮肤屏障的结构基础是角质层的“砖-灰”结构[10-13]。“砖”结构主要包括角质细胞及角质包封结构(Cornified envelope，CE)；“灰”结构主要由脂质板层构成。“砖-灰”结构的本质是角质包封与脂质的交联，形成角质层屏障作用的结构基础。除此之外，细胞间紧密连接也对皮肤屏障具
有重要的贡献。
角质包封结构由多种结构蛋白在转化酶的作用下交联形成。其中部分蛋白(Envoplakin，Periplakin，TGM1，K1/10，Involucrin等)参与CE组装的起始阶段，而其他蛋白(Loricrin，SPRs，Filaggrin，Repetin等)则参与CE组装的晚期加固阶段，以满足不同阶段的分化需求[14]。
K1和K10是在分化过程中合成的骨架蛋白，以代替未分化状态下的K5和K14蛋白中间丝。在更高的分化阶段，细胞合成透明角质颗粒，主要成分为Profilaggrin。当细胞从颗粒层向角质层分化过程中，Profilaggrin被去磷酸化并降解成为Filaggrin。Filaggrin使得角蛋白丝更紧密地聚集，这样使得细胞变成扁平状，形成角化细胞的主要特征[15,16]。内皮蛋白(Ivolucrin)是CE组装过程中的早期组件，为后续其他蛋白的交联提供支持[17]。兜甲蛋白(Loricrin,LOR)富含Gly，Ser和Cys等氨基酸，占角质层总蛋白的70%～85%，在TGM的作用下，LOR与LOR,SPRs交联，对CE进行晚期加固[18]。
上述主要CE组成蛋白的表达水平低下或基因突变导致皮肤屏障功能下降，表现为角质层薄，对外部环境敏感。比如FLG突变是特应性皮炎(AD)的重要病理原因之一，动物试验和基于3D
皮肤模型的FLG基因敲除研究[19-21]证明，FLG基因表达的显著下降(70%～90%)导致荧光素钠等染料分子的经皮渗透显著增加。3D皮肤模型在该研究中的应用，简化了参数条件，更有利于直接说明FLG突变对屏障的影响。但也有研究[22]表明，FLG突变并不对小分子标记物，如荧光素钠以及生物素等的渗透造成影响，提示在复杂病理条件下，屏障损伤可能由多种因素造成，需要关注在3D皮肤模型上获得综合性数据并加以分析。
基于正常角质形成细胞构建的3D皮肤模型可能为促屏障功能化妆品原料和配方的研究以及宣称提供一个有效途径。但在方案设计上，以皮肤屏障的角质包封结构蛋白分子作为关键指标的，需整合基因、蛋白、代谢、渗透屏障等结果，以综合评价化妆品的屏障增强功效[23,24]。
当化妆品暴露于3D皮肤模型后，通过化妆品上调有利于皮肤屏障功能增强的生物指标表达，判定化妆品促屏障功能增强的潜力。传统的基因表达检测通过qRT-PCR实现，但由于其效率较低，单批次研究的基因数量较少等因素，在化妆品功效评价中，越来越多地采用转录组测序技术，以实现高效的基因表达分析。除了在基因水平开展的研究之外，蛋白水平结果既验证了在基因水平的检测结果，又为化妆品功效证明资料提供了可视化的素材。例如，在化妆
品屏障增强功效评价实验中，利用免疫荧光技术对不同处理条件下的3D表皮模型EpiKutis进行蛋白水平分析。与对照组相比，样品处理后，FLG与LOR均显著升高(见图2和3)，证明样品具有同时促进FLG,LOR表达，提升皮肤屏障的功能。
图2 FLG的免疫荧光实验结果图Fig.2 Immunofluorescence results of FLG
图3 LOR的免疫荧光实验结果图Fig.3 Immunofluorescence results of LOR
位于角质层细胞间隙的脂质板层结构在调节皮肤屏障中起着重要的作用。脂质板层含有约50%的神经酰胺、25%的胆固醇、15%的游离脂肪酸以及少量的磷脂，并形成精细的空间结构。神经酰胺主要由鞘氨醇通过酰胺键与脂肪酸组成。脂肪酸碳链长度的变化和鞘氨醇结构的变化导致神经酰胺种类繁多。人角质层神经酰胺根据其脂肪酸和鞘氨醇的结构可以分为12个大类[25]。目前为止，通过LC-MS证实人角质层已有350多种神经酰胺[26,27]。人角质层游离脂肪酸主要是碳链长度为14～28的饱和直链的脂肪酸，其中碳链长度以22碳和24碳为主。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议