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...类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102253216 A

(43)申请公布日 2011.11.23C N 102253216 A

*CN102253216A*

(21)申请号 201110057523.6

(22)申请日 2011.03.10

G01N 33/68(2006.01)

G01N 33/577(2006.01)

G01N 33/558(2006.01)

(71)申请人北京维德维康生物技术有限公司

地址100085 北京市海淀区上地十街1号院

4号楼

申请人中国农业大学

(72)发明人沈建忠江海洋吴小平徐飞

王战辉赵宁杨丽丽李向梅

李艳伟

(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人关畅

(54)发明名称

一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺

类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条

(57)摘要

本发明公开了一种基于青霉素结合蛋白的检

测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试

纸条。本发明的用于检测β-内酰胺类抗生素的

受体试剂盒，包括：SEQ IDNO ：1所示蛋白、酶标记

的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素

G 。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、

准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间

短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优

点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高

通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试

纸及检测方法在β-内酰胺类抗生素的检测中将

发挥重大作用。(51)Int.Cl.

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请

权利要求书 2 页说明书 11 页序列表 10 页附图 2 页

1.一种用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括：SEQ ID NO ：1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G 。

2.根据权利要求1所述的受体试剂盒，其特征在于：所述受体试剂盒还包括底物显液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；

底物显液由A 液和B 液组成，A 液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B 液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；

终止液为0.2M 的硫酸水溶液；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将0.5ml 吐温20、5g 叠氮化钠和990ml 磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M ，pH 值为7.4；

样品稀释液：0.1mol/L 、pH 值为7.2的磷酸盐缓冲液；

每1升包被缓冲液按照如下方法制备：将Na 2CO 31.59g 和NaHCO 32.93g 溶于1升水中，用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；

每1升封闭液按照如下方法配制：将50mgBSA 、1g 叠氮化钠、30g 酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml ，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M ，pH 值为

7.2。

3.根据权利要求1或2所述的受体试剂盒，其特征在于：所述酶标记的氨苄西林为HRP 标记的氨苄西林；

所述标准品溶液为青霉素G 浓度如下的溶液：8.1μg/L 、2.7μg/L 、0.9μg/L 、0.3μg/L 、0.1μg/L 。

4.根据权利要求1-3中任一所述的受体试剂盒，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：

青霉素G 、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III 、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

5.一种检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS 标签的SEQ IDNO ：1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS 标签单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G 、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III 、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

7.根据权利要求5或6所述的胶体金试纸，其特征在于：所述载体蛋白为OVA 。

8.一种检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法，为如下I 或II 所示：

I 、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求1-4中任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述待测样品为牛奶：将牛奶用样品稀释液按1∶4稀释，4℃、10000rpm 离心，取上清液，作为待测样本溶液；

所述待测样品为奶粉：称取1g 奶粉，溶于5mL 样品稀释液中，混合均匀，作为待测样本

溶液。

所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样本溶液；

所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每5g均质样品加入10mL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9∶1；

所述待测样品为蜂蜜：将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。

II、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求5-7中任一所述所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；

所述样品稀释液为0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

9.SEQ ID NO：1所示蛋白在检测β-内酰胺类抗生素中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方

法及专用试剂盒和试纸条

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条。

背景技术

[0002] β-内酰胺类抗生素是一类含有四元β-内酰胺环结构抗生素的统称，是目前医药和兽药行业应用最多的一类抗生素，广泛用于和预防葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌引起的动物尿道、胃肠道、呼吸道感染以及奶牛乳房炎等疾病。长期摄入含有β-内酰胺类抗生素残留的食物可引起细菌耐药性增加，消化系统菌失调，甚至诱发过敏反应。

[0003] 随着人们对食品安全的日益重视，欧盟、中国、美国、日本等国家相继对动物源性食品中β-内酰胺类药物最大残留限量值作出了规定，其中欧盟规定青霉素G、氨苄西林、阿莫西林的MRL为4ppb，苯唑西林、邻氯西林、双氯西林、新青霉素III的MRL为30ppb，头孢噻呋、头孢氨苄的MRL为100ppb，头孢唑啉、头孢哌酮的MRL为50ppb，头孢喹肟的MRL为20ppb。

[0004] 免疫分析方法是目前药物残留检测常用方法之一，其原理是基于抗原抗体的特异性结合，具有高灵敏度、高特异性的特性，其中酶联免疫吸附法和胶体金法又具备高通量、检测快速、操作简便、适用于现场筛查等优势，已广泛应用于药物残留筛查。免疫分析方法建立的基础是抗体，常规的抗体制备方法主要是免疫动物获得多克隆血清以及采用杂交瘤技术获得单克隆抗体，周期长、过程复杂、费用高。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒。[0006] 本发明所提供的用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括：SEQ ID NO：1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准

品溶液，所述标准品为青霉素G。

[0007] 上述受体试剂盒中，所述受体试剂盒还包括底物显液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；

[0008] 底物显液由A液和B液组成，A液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；

[0009] 终止液为0.2M的硫酸水溶液；

[0010] 每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将0.5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

[0011] 样品稀释液：0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液；

[0012] 每1升包被缓冲液按照如下方法制备：将Na2CO31.59g和NaHCO32.93g溶于1升水

中，用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；

[0013] 每1升封闭液按照如下方法配制：将50mgBSA、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

[0014] 上述任一所述受体试剂盒中，所述酶标记的氨苄西林为HRP标记的氨苄西林；[0015] 上述任一所述受体试剂盒中，所述标准品溶液为青霉素G浓度如下的溶液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。

[0016] 上述任一所述受体试剂盒中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

[0017] 本发明的另一个目的是提供一种检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸。[0018] 本发明所提供的检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的SEQ ID NO：1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。

[0019] 上述任一所述胶体金试纸中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

[0020] 上述任一所述胶体金试纸中，所述载体蛋白为OVA。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法。[0022] 本发明所提供的检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法，为如下I或II所示：[0023] I、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

[0024] 1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

[0025] 2)用上述任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

[0026] 所述待测样品为牛奶：将牛奶用样品稀释液按1∶4稀释，4℃、10000rpm离心，取上清液，作为待测样本溶液；

[0027] 所述待测样品为奶粉：称取1g奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，作为待测样本溶液。

[0028] 所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样本溶液；

[0029] 所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每5g 均质样品加入10mL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9∶1；

[0030] 所述待测样品为蜂蜜：将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固

相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。

[0031] II、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：