(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910987413.6
(22)申请日 2019.10.17
(71)申请人 北京新羿生物科技有限公司
地址 100190 北京市海淀区中关村北二条
13号44幢310室
(72)发明人 彭志勇 祝令香 郭永 芮孝
王栋 杨文军 高娜
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6848(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种巢式PCR试剂盒，所述试剂
行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产
物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式
引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引
物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的
特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或
下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩
增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消
化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。本
发明的试剂盒操作简单快捷、扩增效率高和污染
风险低。
权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图2页CN 110592194 A 2019.12.20
C N 110592194
A
1.一种巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。
2.根据权利要求1所述的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述巢式PCR试剂盒是巢式数字PCR试剂盒。
3.根据权利要求2所述的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述巢式PCR试剂盒是非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的巢式数字PCR试剂盒。
4.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述巢式PCR试剂盒中第一轮上游引物是SI D N o .6:C C AC AC UG ACG UG C C U C UC C ；和第一轮下游引物是SI D N o .7:AGGCAGCCGAAGGGCA。
5.根据权利要求4所述的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述巢式PCR试剂盒中第二轮上游引物是上游A
RMS引物SID No.8:GTGGACAACCCCCACCAC；和第二轮下游引物是SID No.9:CGGTGGAGGTGAGGCAGAT。
权 利 要 求 书1/1页CN 110592194 A
一种巢式PCR试剂盒
技术领域
[0001]本发明PCR技术领域，具体涉及一种巢式PCR试剂盒。
背景技术
[0002]巢式PCR是一种使用两对引物进行两轮扩增的PCR技术，巢式PCR一般使用一对外部引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用一对内部引物(也称为巢式引物)进行第二轮扩增。巢式PCR克服了普通PCR单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性。由于模板和引物的改变，降低了非特异反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。得益于巢式PCR的高灵敏度和高特异性，巢式PCR广泛应用于病原体检测、肿瘤等疾病的伴随诊断中。
[0003]巢式PCR在实际应用中仍存在一些问题。外部引物加入量过低，则影响第一轮扩增的扩增效率，外部引物加入量过高，则外部引物残留可能对第二轮扩增造成影响。目前常用的解决方案是增加第一轮PCR的循环数，尽量消耗外部引物，然后对第一轮PCR产物进行高倍稀释，以降低进入第二轮PCR的残留外部引物量。但是，在临床应用上，增加第一轮PCR循环数会增加整个临床检测的时间，而且对高拷贝数的第一轮PCR产物进行稀释或其他操作很容易造成PCR产物污染，不利于临床检测。
发明内容
[0004]为了解决上述问题，本发明旨在提供一种巢式PCR试剂盒，该PCR试剂盒在保持高扩增效率的同时，解决了巢式PCR外部引物残留而对第二轮PCR造成的影响，并且严格控制了第一轮PCR扩增循环数和产物量，适用于临床检测。
[0005]在第二轮PCR扩增前，在PCR混合液中添加UNG酶，并设置合适的孵育温度和时间即可消除第一轮PCR扩增引物。由于UNG酶在PCR循环中95℃变性步骤中可被灭活，因此不会影响后续实验。高品质的UNG酶可以消除高达108的含dU PCR产物。
[0006]在一种实施方式中，本发明提供一种巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的
特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。
[0007]在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是巢式数字PCR试剂盒。
[0008]在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的巢式数字PCR试剂盒。
[0009]在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第一轮上游引物是SI D No.6: CCACACUGACGUGCCUCUCC；和第一轮下游引物是SID No.7:AGGCAGCCGAAGGGCA。
[0010]在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第二轮上游引物是上游ARMS引物SID
No.8:GTGGACAACCCCCACCAC；和第二轮下游引物是SID No.9:CGGTGGAGGTGAGGCAGAT。[0011]本发明试剂盒具有以下优点，本发明实现了如下技术效果：
[0012]1)操作简单快捷：不需要增加第一轮PCR的循环数，不需要对第一轮PCR产物进行稀释。
[0013]2)扩增效率高：检出拷贝数/投入拷贝数达到了10倍，能满足放大低丰度模板的需求。
[0014]3)污染风险低：将第一轮PCR扩增循环数控制在少量循环，使第一轮PCR产物量控制在能满足需求的最低量，将操作PCR产物时的污染风险降到最低。
附图说明
[0015]为更好体现本发明PCR鉴定体系的特异性与准确性，将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0016]图1是当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的数字PCR扩增结果图；
[0017]图2是当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins突变型模板的数字PCR扩增结果图；
[0018]图3是进行第一轮预扩增，然后进行第二轮数字PCR检测时，投入20ins野生型模板的常规数字PCR扩增结果图；
[0019]图4是当投入20ins野生型模板，使用本发明试剂盒数字PCR扩增结果图；和[0020]图5是当投入200拷贝20ins突变型模板，使用本发明试剂盒数字PCR扩增结果图。
具体实施方式
[0021]为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0022]以非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测中巢式PCR的应用为例(数字PCR平台)，介绍一种巢式PCR外部引物的设计方法。
[0023]用于检测引物探针性能的微液滴数字PCR反应条件示例如下：首先通过核酸提取试剂盒对临床样本核酸进行提取，然后配制PCR扩增体系，PCR扩增反应混合物包括：2×MasterMix预混液(Bio-Rad)、引物各200-1000nM、模板DNA 10-200ng，补水到20μL，将试剂混匀。用微液滴生成仪(Bio-Rad)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：
[0024]
[0025]PCR扩增后，用QX200阅读仪(Bio-Rad)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。通过荧光信号检测20ins突变型，并对其直接进行绝对定量。
[0026]当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的检测结果如图1，图1中纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，黑点代表无扩增的阴性信号点。图1说明直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的检测图中只出现无扩增的阴性信号点，未出现突变型信号点，即FAM阳性点，表明20ins突变检测体系特异性良好。
[0027]当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins突变型模板的检测结果如图2，图2中纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，蓝点代表突变型信号点，黑点代表无扩增的阴性信号点。图2中可以看出20ins突变检测体系检测突变型模板时的状态，即出现一堆FAM阳性信号点。
[0028]为提高非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的灵敏度，配制20μL第一轮普通PCR 扩增体系，用外部常规引物进行第一轮8个循环的普通PCR扩增，放大初始模板量。扩增条件设定如下：
[0029]
[0030]然后取2μL第一轮PCR的产物，作为第二轮数字PCR的模板，生成微液滴后，将含有微液滴的PCR管放置在PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：
[0031]
[0032]第一轮普通PCR引物为常规引物，第二轮数字PCR的上游引物为ARMS引物。引物设计如下表：
[0033]
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