(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910995495.9
(22)申请日 2019.10.18
(71)申请人 纳昂达（南京）生物科技有限公司
地址 210046 江苏省南京市栖霞区纬地路9
号江苏生命科技创新园D6栋910室
(72)发明人 胡玉刚 汪彪 郑文莉 吴强
(74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限
责任公司 11240
代理人 路秀丽
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称用于PCR扩增的引物、试剂盒、检测MSI状态的方法及应用(57)摘要本发明提供了一种用于PCR扩增的引物、试剂盒、检测MSI状态的方法及应用。该引物包括目标序列扩增区域和设置在目标序列扩增区域3’末端的封闭区域，封闭区域具有R(D)n1DsDsDx或R(D)n2DsDsMx所示结构，其中，R表示RNA碱基，D 表示互补配对碱基，M表示错配碱基，n1和n2表示括号中D碱基的个数，n1为1或2，n2为2，s表示相邻的两个核苷酸之间的3’氧原子进行硫代修饰，x表示封闭修饰。最后三个碱基间的硫代连接防止末端带封闭修饰的碱基被酶切掉，故可采用高保真酶扩增，且既能保证扩增的准确性，又不产生非特异扩增和引物二聚体，从而提高了MSI状 态检测的准确性。
权利要求书3页 说明书15页序列表51页 附图5页CN 110628882 A 2019.12.31
C N 110628882
A
1.一种用于PCR扩增的引物，其特征在于，所述引物包括目标序列扩增区域和设置在所述目标序列扩增区域3’末端的封闭区域，所述封闭区域具有R(D)n1DsDsDx或R(D)n2DsDsMx 所示结构，其中，R表示RNA碱基，D表示互补配对碱基，M表示错配碱基，n1和n2表示括号中D 碱基的个数，n1为1或2，n2为2，s表示相邻的两个核苷酸之间的3’氧原子进行硫代修饰，x表示封闭修饰。
2.根据权利要求1所述引物，其特征在于，所述封闭修饰选自如下任意一种：MGB修饰、C3间臂修饰，3’磷酸化修饰，3’修饰，3’生物素修饰及3’端的碱基为双脱氧碱基。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述引物为扩增以下位点的引物：
其中，a表示重复单元，b表示所述重复单元的重复次数。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:70至SEQ ID NO: 207所示。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1至4中任一项所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序平台接头通用引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述通用引物为：SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的MGI测序平台的通用引物，或者，所述通用引物为SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的Illumina测序平台的通用引物。
8.一种检测MSI状态的方法，所述方法包括对目标MSI位点进行PCR扩增检测的步骤，其
特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述的引物进行扩增；或者采用权利要求5至7中任一项所述的试剂盒进行扩增。
9.权利要求1至4中任一项所述的引物在制备检测MSI状态的试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为扩增子文库构建试剂盒。
用于PCR扩增的引物、试剂盒、检测MSI状态的方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及高通量测序检测领域，具体而言，是一种用于PCR扩增的引物、试剂盒、检测MSI状态的方法及应用。
背景技术
[0002]在人类基因组中，广泛分布着许多短的(1-6个碱基)串联重复DNA序列，即微卫星序列(MicroSatellite，MS)。微卫星不稳定性(MicroSatellite Instability，MSI)是指某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。由于错配修复基因功能丧失，在细胞增殖的过程中，导致DNA复制时，这些序列常发生小范围的碱基缺失，插入或者替换不被修复状态。根据MSI不稳定性的程度，可分为微卫星高度不稳定型(M S I -H)、微卫星低度不稳定型(M S I -L)和微卫星稳定型(microsatellite stability，MSS)。
[0003]传统的检测MS位点的稳定性主要是采用PCR扩增结合毛细管电泳的方法，由于这种方法检测的位点数量有限，一般只是检测6个常见位点，大于等于2个位点不稳定判断是微卫星高度不稳定型(MSI -H)，有1个位点不稳定判断是，微卫星低度不稳定型(MSI -L)，没有位点被发现不稳定判定是微卫星稳定型(microsatellite stability，MSS)。所以检测的准确性和检测的科学性有待进一步提升。
发明内容
[0004]本发明提供了一种用于PCR扩增的引物、试剂盒、检测MSI状态的方法及应用，以减少PCR扩增目的片段时的非特异性扩增，从而提高对MSI状态检测的准确性。
[0005]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于PCR扩增的引物，该引物包括目标序列扩增区域和设置在目标序列扩增区域3’末端的封闭区域，封闭区域具有R(D)n1DsDsDx或R(D)n2DsDsMx所示结构，其中，R表示RNA碱基，D表示互补配对碱基，M表示错配碱基，n1和n2表示括号中D碱基的个数，n1为1或2，n2为2，s表示相邻的两个核苷酸之间的3’氧原子进行硫代修饰，x表示封闭修饰。
[0006]进一步地，封闭修饰选自如下任意一种：MGB修饰、C3间臂修饰，3’磷酸化修饰，3’修饰，3’生物素修饰及3’端的碱基为双脱氧碱基。
[0007]进一步地，引物为扩增表1所示位点的引物。
[0008]进一步地，引物如SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:207所示。
[0009]根据本发明的第二个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述任一种引物。
[0010]进一步地，试剂盒还包括测序平台接头通用引物。
[0011]进一步地，通用引物为：SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的MGI测序平台的通用引物，或者，通用引物为SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的Illumina测序平台的通用引物。
[0012]根据本发明的第三个方面，提供了一种检测MSI状态的方法，该方法包括对目标
说 明 书1/15页CN 110628882 A
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