(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010354216.3
(22)申请日 2020.04.29
(71)申请人 盐城师范学院
地址 224007 江苏省盐城市希望大道南路2
号
(72)发明人 高学仁 汪欣雨 倪文文 孙雨琦
(74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司
32252
代理人 蒋厦
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6886(2018.01)
C12Q 1/6858(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种检测结直肠癌易感性的试
剂盒，包括多重PCR扩增试剂：ExTaq premix，PCR
引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7
基因上的r s 7439366 C >T ，L E P 基因上的
rs2167270 G>A，IL10基因上的rs1800871 T>C，
MIR27A基因上的rs895819 T>C，IGF1基因上的
rs35767 C>T，MTHFR基因上的rs1801133 C>T、
CCND1基因上的rs9344 G>A位点的基因型，识别
结直肠癌高危人。
权利要求书1页 说明书5页序列表4页 附图1页CN 111394466 A 2020.07.10 C N 111394466
A
1.一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：包括多重PCR扩增试剂：ExTaq premix，PCR引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366 C>T，LEP基因上的rs2167270 G>A，IL10基因上的rs1800871 T>C，MIR27A基因上的rs895819 T>C，IGF1基因上的rs35767 C>T，MTHFR基因上的rs1801133 C>T、CCND1基因上的rs9344 G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人。
2.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：还包括用于采集口腔粘膜细胞的棉签；DNA提取试剂：Chelex -100，蛋白酶K ；基因型检测试剂：SAP酶，Exonuclease I酶。
3.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测UGT2B7基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.15。
4.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测LEP基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.16。
5.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IL10基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.17。
6.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MIR27A基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.18。
7.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IGF1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.19。
8.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MTHFR基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.20。
9.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测CCND1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.21。
权 利 要 求 书1/1页CN 111394466 A
一种检测结直肠癌易感性的试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测结直肠癌易感性的试剂盒。
背景技术
[0002]结直肠癌是一种严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤。根据世界卫生组织发布的最新版《全球癌症报告》数据显示，2018年全球结直肠癌新发病例数超过180万，约占癌症发病的10.2％[1]。如何有效防治结直肠癌已成为医学界面临的重大基础和临床研究课题之一。流行病学研究表明，吸烟、酗酒、高脂饮食及久坐等外在因素与结直肠癌的发生有关，然而在上述背景下，并不是所有个体都会罹患结直肠癌，说明个体内因——遗传易感性也起着关键作用。
[0003]单核苷酸多态性是指在基因组中单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失。它在人类基因组DNA中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，其总数多达300万个。单核苷酸多态性是继可变数目串联重复多态性之后的新一代遗传标记，具有高密度、稳定遗传和易于分型检测的特点，因而在疾病特别是多基因疾病研究领域显示出巨大优势。近期荟萃分析结果表明，多个基因上的单核苷酸多态性位点(UGT2B7基因上的rs7439366C>T[2]，LEP基因上的rs2167270G>A[3]，IL10基因上的rs1800871T>C[4]，MIR27A基因上的rs895819T>C[5]，IGF1基因上的rs35767C>T[6]，MTHFR基因上的rs1801133C>T[7]和CCND1基因上的rs9344G>A[8])与结直肠癌易感性存在显著关联。因此，鉴定待测者上述7个位点的基因型将有助于识别结直肠癌高危人，对于实施明确的个体化预防及有着重大的现实意义。然而先前针对上述位点的检测，大多以外周血基因组DNA为模版并只对单个基因上的位点进行检测。目前尚无经济、高效、可靠的试剂盒用于无创检测待测者上述7个位点的基因型。
[0004]参考文献
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发明内容
[0013]为了无创、高效、经济、准确的检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366C>T，LEP基因上的rs2167270G>A，IL10基因上的rs1800871T>C，MIR27A基因上的rs895819T>C，IGF1基因上的rs35767C>T，MTHFR基因上的rs1801133C>T和CCND1基因上的rs9344G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人。本发明提供了一种检测结直肠癌易感性的试剂盒。该试剂盒能够提取口腔粘膜细胞DNA，基于测序仪同时检测待测者上述7个位点的基因型。
[0014]为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
[0015]一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，包括多重PCR扩增试剂：ExTaq premix，PCR引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366C>T，LEP基因上的rs2167270G>A，IL10基因上的rs1800871T>C，MIR27A基因上的rs895
819T>C，IGF1基因上的rs35767C>T，MTHFR基因上的rs1801133C>T、CCND1基因上的rs9344G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人。
[0016]还包括用于采集口腔粘膜细胞的棉签；DNA提取试剂：Chelex-100，蛋白酶K；基因型检测试剂：SAP酶，Exonuclease I酶。
[0017]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测UGT2B7基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.15。
[0018]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测LEP基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.16。[0019]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IL10基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.17。[0020]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MIR27A基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.18。
[0021]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IGF1基因的PCR扩增引物
的序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.19。[0022]其
PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MTHFR基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.20。
[0023]其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测CCND1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.21。
[0024]本发明试剂盒中PCR引物组序列具体如下：
[0025]用于特异性扩增含UGT2B7基因上的rs7439366C>T位点序列的引物：
[0026]F-GACAATGGGGAAAGCTGACG，
[0027]R-AGTCAAACACTCTGAAAGAAGACTATAGAA；
[0028]用于特异性扩增含LEP基因上的rs2167270G>A位点序列的引物：
[0029]F-TGTGATCGGGCCGCTATAAG，
[0030]R-GCCAAGAAAGACCAGCAGAGAAG；
[0031]用于特异性扩增含IL10基因上的rs1800871T>C位点序列的引物：
[0032]F-GGAGATGGTGTACAGTAGGGTGAGG，
[0033]R-GGGGAAGTGGGTAAGAGTAGTCTGC；
[0034]用于特异性扩增含MIR27A基因上的rs895819T>C位点序列的引物：
[0035]F-GCAGGATGGCAGGCAGACA，
[0036]R-GGATTTCCAACCGACCCTGA；
[0037]用于特异性扩增含IGF1基因上的rs35767C>T位点序列的引物：
[0038]F-CCAGGATAACACAAAGAGCCAGAGTA，
[0039]R-GCAAAAGCCCAGAGCAGACATA；
[0040]用于特异性扩增含MTHFR基因上的rs1801133C>T位点序列的引物：
[0041]F-AAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT，
[0042]R-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATG；
[0043]用于特异性扩增含CCND1基因上的rs9344G>A位点序列的引物：
[0044]F-CAGTGCAAGGCCTGAACCTGA，
[0045]R-ACTAGGTGTCTCCCCCTGTAAGC。
[0046]本发明中单碱基延伸引物组序列具体如下：
[0047]用于检测UGT2B7基因上的rs7439366C>T位点基因型的单碱基延伸引物：[0048]AATCAACATTTGGTAAGAGTGGAT；
[0049]用于检测LEP基因上的rs2167270G>A位点基因型的单碱基延伸引物：
[0050]GTAGGAATCGCAGCGCCA；
[0051]用于检测IL10基因上的rs1800871T>C位点基因型的单碱基延伸引物：
[0052]GAGCAAACTGAGGCACAGAGAT；
[0053]用于检测MIR27A基因上的rs895819T>C位点基因型的单碱基延伸引物：[0054]GCTTGTGAGCAGGGTCCAC；
[0055]用于检测IGF1基因上的rs35767C>T位点基因型的单碱基延伸引物：
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