(10)申请公布号 (43)申请公布日 2015.01.14
C N 104280446
A (21)申请号 201310277546.7
(22)申请日 2013.07.04
G01N 27/447(2006.01)
(71)申请人辽宁药联制药有限公司
地址117004 辽宁省本溪市经济开发区香槐
路122A
(72)发明人于航 王钝 陶闰红 毕红书
毕璟璐 左莉华
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵
对映体以及对映体杂质检查的方法。通过毛细管
对映体单体的峰位，并按杂质对照法计算格隆溴
铵中对映体的限度；用水配制各供试品样品，毛
细管电泳缓冲液为磷酸二氢钠缓冲溶液，在缓冲
盐中加入磺酸化-β-环糊精（S-β-CD ）。采用毛
细管电泳法分离格隆溴铵分离效果好，样品用量
低，无污染，成本低，适合消旋格隆溴铵的拆分。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书3页 附图5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图5页(10)申请公布号CN 104280446 A
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1.一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，主要包括样品的制备，毛细管电泳条件的考察及分析方法；通过毛细管电泳将格隆溴铵及其对映异构体分离，并确认格隆溴铵四个对映体单体的峰位；用水配制各供试品样品，毛细管电泳缓冲液为磷酸二氢钠缓冲溶液，在缓冲盐中加入S-β-CD 。
2.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：缓冲液的配置：10-50mM 磷酸盐缓冲溶液，用适当的酸和碱溶液调节溶液的PH 值，其中酸可以选择磷酸、盐酸、硫酸、甲酸等药学上可接收的酸，碱可以选择氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨等药学上可接受的碱。
3.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：
手性选择剂在缓冲浓度范围为0.5%-3%，其中选择剂为β-环糊精(β-CD)，羟丙基β-环糊精(HP-β-CD)，甲基-β-环糊精(M-β-CD)，羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)和S-β-CD 等环糊精。
4.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：电泳条件参数为：毛细管总长度为50.2cm ，有效长度为40cm ，毛细管内径为50μm，运行电压为15-30kV ，毛细管温度为20-30℃，压力进样0.5psi ，5s ，电极：reverse, (pH 3.0-
5.0), normal(pH
6.0-8.0)，检测波长：190-230 nm 均可。
5.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：用水或缓冲液配置消旋格隆溴铵分析样品，以及4个对映体异构体单体样品。
6.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：运行电压为20kV ，毛细管温度为25℃，缓冲液浓度为30mM NaH2PO4，pH3.5±0.2或者
7.0±0.2，手性选择剂为S-β-CD 。
7. 根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：
消旋格隆溴铵分别加入4个对映体异构体单体样品，分别进样，得到4个对映体的峰位为：RS,SS,SR,RR(pH 3.5±0.2) ，RR,SR,SS,RS （pH 7.0±0.2）。
8.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：格隆溴铵对映体的计算方法是分别配置格隆溴铵供试品溶液以及含有1%格隆溴铵对映异构体对照品的格隆溴铵对照品溶液，分别进样，格隆溴铵单体的供试品溶液中对映体杂质的相对应的峰面积不得大于对照溶液中对映体异构体的峰面积。
9.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：可以在采用该方法对格隆溴铵及异构体进行分离的同时，使用外标法计算格隆溴铵及异构体的含量。
10.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法，其特征是：当格隆溴铵及异构体与其他药物配伍使用时，可以采用该方法检查混合液中格隆溴铵及异构体的含量。权 利 要 求 书CN 104280446 A
一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检
查的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种毛细管电泳法拆分外消旋药物毒蕈碱受体拮抗剂格隆溴铵四种手性对映体以及其对映体杂质检查方法的研究。
背景技术
[0002] 格隆溴铵(G1ycopyrronium Bromide)为季铵类抗胆碱药，其结构中含有两个手性碳原子，存在两对对映异构体（RS,SS,SR,RR），即四个手性对映体，国内外己上市产品均为各对映体的混合物，即为外消旋药物，其结构如(Ⅰ)所示。
[0003] (Ⅰ)
手性对映体尤其是手物的拆分近年来已成为分析化学领域的重要课题之一，这是由于药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配实现的，即手物与生命体中的药物靶点发生作用时具有显著的立体选择性，因此，在许多情况下，其化合物的不同对映体在生物体内呈现很大的药效学、药动学的差异，毒理作用的表现也会不同甚至完全相反。据研究得知，(3S, 2′R)-格隆溴铵的胆碱能拮抗作用最差，而(3R, 2′S)-格隆溴铵具有最强的胆碱能拮抗作用。
[0004] 随着人们对手物对映体之间生物活性差异的认识，逐渐意识到发展单一对映体药物的重要性，现在世界上各大制药公司对单一对映体药物的日益重视不仅反映在新药开发上，更主要的意义是对已上市外消旋药物再开发成为单一异构体药物，因为这要比开发一个全新药物更省时省钱，且单一对映体药物可能疗效更好、安全性更高、毒副反应较少，而这种疗效最好、安全性高的新药正是国内外医药行业所努力的目标。因此，对外消旋药物通过手性拆分途径开发单一对映体药物其前景非常可观的。
[0005] 本专利针对外消旋药物格隆溴铵的手性拆分展开研究，并通过4个对映体单体进行确定峰位，对各对映体进行含量测定（当以某种单体为主药时）及对映体杂质含量测定（当对映体为杂质时），其深层意义为开发单一异构体新药测定其含量、测定杂质（其他三种对映异构体）的含量。
[0006] 目前用于手物分离的方法常用的方法有手性高效液相谱法，通过在流动相中加入手性选择剂或采用手性谱柱进行分离检查，前者往往分离效果不好，专属性不强，后者谱柱较贵，成本较高，通常需要几类不同的手性液相谱柱来满足某一特定的分析要求，要到能适合拆分格隆溴铵的谱柱需要很大的消耗，应用的范围较窄等缺点；气相谱法用于手物对映异构体的检查要求样品具有一定的挥发性及热稳定性，应用很有局限性。
发明内容
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体的方法，确认格隆溴铵四
个对映体单体的峰位，并按杂质对照法计算格隆溴铵中对映体的限度。本发明是这样实现的，它主要包括样品的制备，毛细按电泳条件及分析方法；通过考察毛细管电泳的影响因素，例如，手性选择剂的选择，环糊精的浓度，背景电解质pH，缓冲液浓度，电压以及温度对格隆溴铵及其异构体分离的影响，综合考虑分离时间以及峰形，选择最佳分离条件。在消旋格隆溴铵样品中加入对映体单体，对峰位进行确证。最后，建立了杂质对照法对格隆溴铵中的对映体杂质的进行检测。
[0008] 本文考察了β-环糊精，羟丙基β-环糊精，甲基-β-环糊精，羧甲基-β-环糊精和磺化-β-环糊精5种手性选择剂对消旋格隆溴铵的手性拆分，由于磺化-β-环糊精对格隆溴铵的拆分能力最好，最后选择磺化-β-环糊精为手性选择剂。手性选择剂在缓冲液中的浓度范围为0.5~3.0%，最优的浓度为2%。电泳条件参数为：毛细管总长度为50.2cm，有效长度为40cm，毛细管内径为50μm，运行电压为15-30kV，毛细管温度为20-30℃，压力进样0.5psi，5s。pH3.0~5.0范围内，检测模式为“reverse”，即负极进样，正极检测；当pH6.0~8.0范围内，检测模式为“normal”，即正极进样，负极检测。综合考虑分析时间和峰形，选择pH3.5±0.2和pH7.0±0.2。优选的缓冲盐浓度为30mM磷酸盐缓冲液，运行电压20kV，毛细管的温度25℃。
[0009] 在消旋格隆溴铵分别加入4个对映体异构体单体样品，在分别在pH3.5和pH7.0条件下对峰位进行确证，得到4个对映体的峰位分别为：RS,SS,SR,RR(pH 3.5±0.2) ，RR,SR,SS,RS（pH 7.0±0.2）。
[0010] 用水配制格隆溴铵手性物分析样品，对映异构体的浓度1μg/ml~50μg/ml，主峰的浓度在0.2mg/ml。格隆溴铵对映异构体的计算方法是配制格隆溴铵供试品溶液及含1%格隆溴铵对映异构体对照品的格隆溴铵的对照品溶液(2μg/ml)，分别进样，格隆溴铵供试品溶液中对映异构体的相应的峰面积不得大于对照溶液中对映异构体的峰面积。[0011] 新毛细管柱需要用1.0 mol·L-1 NaOH溶液冲洗30 min进行活化，然后用重蒸水冲洗10 min。每天实验开始前，依次用0.1 mol·L-1NaOH溶液、重蒸水、背景电解质分别冲洗10 min。进样间用背景电解质溶液冲洗2 min后进行下次进样。
[0012] 毛细管电泳用于手物异构体的检查有高效、快速、操作简便、样品用量少，成本低，格隆溴铵及其对映异构体能够基线分离等优点，其较高的分离效率使分离选择系数较小的对映异构体可以得到满意的分离效果。用于毛细管电泳手性拆分的选择剂的种类较多，其中以环糊精应用得最广，而且容易得到，在手性拆分中具有广阔的应用前景。[0013]
本发明的特征和优势将通过下列实施例和附图得以明确。
附图简述
图1是pH3.5条件下消旋格隆溴铵的毛细管电泳图
图2是pH7.0条件下消旋格隆溴铵的毛细管电泳图
图3是pH3.5条件下(3R, 2′S)-型格隆溴铵杂质毛细管电泳检测图
图4是pH3.5条件下(3S, 2′R)-型格隆溴铵杂质毛细管电泳检测图
图5是pH7.0条件下(3S, 2′S)-型格隆溴铵杂质毛细管电泳检测图
图6是pH7.0条件下(3R, 2′R)-型格隆溴铵杂质毛细管电泳检测图
图7是pH3.5条件下(3R, 2′S)-型格隆溴铵毛细管电泳含量检测图
图8是pH3.5条件下(3S, 2′R)-型格隆溴铵毛细管电泳含量检测图
图9是pH7.0条件下(3S, 2′S)-型格隆溴铵毛细管电泳含量检测图
图10是pH7.0条件下(3R, 2′R)-型格隆溴铵毛细管电泳含量检测图
具体实施方式：
实施例1
实验仪器： P∕ACE TM MDQ 高效毛细管电泳仪（Beckman，USA），PDA检测器（Beckman，USA），
压力进样，毛细管总长50.2cm，有效长度40cm，内径50μm的熔融石英毛细管柱。[0014] 样品的配制过程如下：
配制30mmol/L的磷酸二氢钠溶液，用浓度为0.1M的H
3PO
4
或者NaOH调节pH3.5或7.0
作为缓冲液，含有2% S-β-CD作为手性选择剂。用水溶液分别配制格隆溴铵溶液浓度为0.1mg/ml。进样前依次用0.1 mol·L-1NaOH溶液、重蒸水、背景电解质分别冲洗10 min。实验温度：25℃，检测波长：190-230 nm，压力进样0.5psi，5s；结果见图1为pH3.5条件下消旋格隆溴铵的毛细管电泳图，图2为pH7.0条件下消旋格隆溴铵的毛细管电泳图。[0015] 实施例2：
电泳条件同实施例1。用水溶液配制，分别配制格隆溴铵一个对映体主峰和另外三个对映异构体的混合溶液，其对映异构体的浓度为主峰对映体的1%，即主峰的浓度为0.2mg/ ml，对映体杂质的浓度为2.0μg/ml。其中，对映体RS和SR的杂质检查pH条件为3.5，见图3和4，对映体SS和RR杂质检查的pH 条件为7.0，见图5和6。
[0016] 实施例3：
电泳条件同实施例1。用水溶液配制，分别配制格隆溴铵新合成4个对映体单体的样品溶液为供试品溶液，浓度为0.2mg/ml。检查新合成的单体中其他对映体杂质的含量。对映体RS和SS的条件为pH条件为3.5，见图7和8，对映体SS和RR杂质检查的pH 条件为7.0，见图9和10。通过图7-10和图3-6的限量图相比较，我们可以看出，新合成的对映体单体中，RS和SR均不还有其他对映体杂质，而SS和RR含有其他对映体杂质，其中，SS中含有RS对映体杂质，限量小于1%，RR中含有SR对映体杂质，限量小于1%。
[0017] 结论
本专利建立了一种毛细管电泳法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的高效毛细管电泳法。本方法简单，分离效率高，分离速度快，进样量少，分析成本低。一般只需一些常用的试剂，所有试剂用量均较少，与高效液相方法比分析成本低很多。其有益的效果主要表现在：
（1）分离效能高，实现四个对映体的手性分离；分离时间短，15分钟之内实现分离，并且满足杂质检查的要求；
（2）样品用量少：每次进样所需样品只有几nl；
（3）环境友好：所用的缓冲液均为水溶液，无需使用有机溶剂，比HPLC方法更环保；
（4）分析成本低：所需的毛细管柱及试剂相对于HPLC手性柱的成本低很多。
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