(10)申请公布号 CN 102798723 A
(43)申请公布日 2012.11.28C N 102798723 A
*CN102798723A*
(21)申请号 201210274507.7
(22)申请日 2012.08.03
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/577(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
(71)申请人北京华创远航科技有限公司
地址100085 北京市海淀区开拓路5号中关
村生物医药园A204
(72)发明人邹检平
(54)发明名称
(57)摘要
光检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF 单克隆
抗体包被的固体反应板、辣根过氧化物酶（HRP ）
标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、VEGF 标准
品、样品稀释液、PBST 浓缩洗液、鲁米诺配置的发
光底物、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、
糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，
具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 5 页
1/1页
1.一种发光检测试剂盒，其组成为：
反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A 、B 和封板胶纸；
其中：
反应板为血管内皮细胞生长因子单克隆抗体包被的固体反应板； 酶结合物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体。
2.权利要求1的试剂盒，其特征在于：
标准品为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；
样品稀释液为0.05%吐温-20, 1%牛血清白蛋白，10mM 乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl ，pH6.5;
浓缩洗涤液为137mM NaCl ，2.7 mM KCl, 10mM Na 2HPO 4，2 mMKH 2PO 4 , 0.05%吐温-20, Ph7.4；
发光底物A 、B ，其中发光底物A 为H 2O 2溶液，发光底物B 为鲁米诺溶液。
3.权利要求1的试剂盒，其特征在于，各物质的量以发光板的孔数为标准。
4.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述发光板为96孔。
5.上述试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为：
（a ）将血管内皮细胞生长因子单克隆抗体包被于固体支持物发光反应板上；
（b ）用封闭液封闭；
（c ）将生物标本加入到预包被的发光反应板反应孔中，生物标本中的血管内皮细胞生长因子特异地与血管内皮细胞生长因子单克隆抗体结合；
（d ）用血管内皮细胞生长因子多克隆抗体检测血管内皮细胞生长因子；
（e ）发光底物为鲁米诺溶液。
6.权利要求5的方法，其特征在于，步骤a 所述的单克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫小鼠所得。
7.权利要求5的方法，其特征在于，步骤c 所述的生物标本为癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的血清、血浆、脑脊液、唾液、组织提取液或尿液。
8.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d 所述的血管内皮细胞生长因子多克隆抗体制备用的血管内皮细胞生长因子用昆虫细胞表达并用Ni 柱纯化。
9.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d 所述的多克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫家兔所得。
10.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d 所述的多克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。
11.权利要求6的方法，其特征在于，所述的血管内皮细胞生长因子用昆虫细胞表达并用Ni 柱纯化。权 利 要 求 书CN 102798723 A
一种化学发光检测试剂盒及制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的化学发光检测试剂盒。
背景技术
[0002] 肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管内皮细胞生长因子（VEGF）在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用（Ferrara et al. Endocr. Rev.1997,18:4-25）。
[0003] VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。
[0004] VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力（Kendall et al. PNAS USA, 1993, 90: 10705-9）。
[0005] VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤（即癌症）疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。
[0006] 化学发光免疫测定(chemiluminesent immunoassay，CLEIA)是免疫测定技术继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴测定技术。其基本原理是将化学发光
系统与免疫反应相结合，以检测样本中的抗原或抗体，由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位，广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快捷、标记物稳定、无污染、仪器简单经济等有点。
[0007] 目前，用过氧化氢和辣根过氧化物酶（HRP）联合催化鲁米诺类化合物发光的化学发光免疫测定效果比较好，应用比较广泛。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种化学发光免疫检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的检测试剂盒。该试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。[0009] 本发明的另一目的是提供上述发光检测试剂盒的生产制备及使用方法。[0010] 为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为：
1. 反应板；
2. 酶结合物；
3. 标准品；
4. 样品稀释液；
5. 浓缩洗涤液；
6. 发光底物
A、B；7. 封板胶纸。
[0011] 本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下：
（a）以发光反应板为固体支持物，将VEGF单克隆抗体包被于固体支持物上；
（b）用封闭液封闭；
（c）将生物标本与固定于发光板上的VEGF单克隆抗体接触和保温，生物标本中的VEGF 特异地与VEGF单克隆抗体结合；
（d）从VEGF单克隆抗体上分离生物标本；
（e）用辣根过氧化物酶（HRP）标记的VEGF多克隆抗体检测VEGF，所用的发光底物为鲁米诺溶液。
[0012] 本发明试剂盒的独特性在于，它使用VEGF单克隆抗体包被发光板，能够确保VEGF 能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。
[0013] 本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。
具体实施方式
[0014] 下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。[0015] 实施例1：
本发明的试剂盒举例可以是下列物质：
（1）VEGF单克隆抗体包被固体发光板；
（2）酶结合物：辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体， 1瓶；
（3）VEGF标准品，2支；
（4）样品稀释液：0.05%吐温-20, 1%牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，1瓶 ;
（5）浓缩洗涤液为：137mM NaCl，2.7 mM KCl, 10mM Na
2HPO
4
，2 mM KH
2
PO
4
, 0.05%吐
温-20, Ph7.4， 1瓶；
（6）发光底物A、B，其中A液为H
2O
2
溶液，B液为鲁米诺溶液，各1瓶；
（7）封板胶纸 2张。
[0016] 本例所述的各种物质量均以发光板为96孔（12条8孔或8条12孔）的例子计算的，如果发光板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也相应或多或少。
[0017] 其制备方法：
（1）VEGF基因的克隆
以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件：94℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃保温10分钟，
反应体系：ddH
O 20.0μl
2
10×Buffer 2.5μl
dNTP(10mM) 0.5μl
3＇primer(100ng/μl) 0.5μl
5＇primer(100ng/μl) 0.5μl
Taq酶（5U/μl） 0.5μl
模板NDA 0.5μl
总体积 25μl
凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体pMT18-T中，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为pMT18-1。DNA序列分析由上海博亚生物工程有限公司完成。
[0018] （2）昆虫表达载体的构建
用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pMT18-1，回收VEGF基因片段。同时用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pFastBac-HT , 回收4.7kb片段。将VEGF基因片段与4.7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1。用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确。
[0019] 将载体pFastBac-1转化DH10Bac感受态细胞。采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑。将菌落挑到2ml LB培养基中，37℃, 250rpm振荡培养12小时。
[0020] 提取培养的菌液中的质粒方法如下：
（a）将1.5ml 菌液转入离心管中，10,000rpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；
（b）加300μl溶液Ⅰ（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl , 10mM EDTA , pH8.0）, 在震荡器上振荡混匀；
（c）加300μl现配的溶液Ⅱ（0.2N NaOH，1%SDS），混匀，室温放置5分钟；
（d）加300μl预冷的溶液Ⅲ（5M KAc，pH5.5），冰浴5分钟；
（e）12,000rpm离心15分钟；
（f）转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；
（g）10,000-12,000rpm离心10分钟；
（h）用70%和无水乙醇洗涤沉淀；
（i）吹干，溶于50μl加RNase的TE（10mM Tris-HCl ; 1mM EDTA,pH8.0）中，于37℃放置一小时，置于-20℃备用。
[0021] 对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法。
[0022] （3）转染昆虫细胞（以sf9细胞为例，但不仅限于sf9细胞，采用sf21、sf158、c127细胞株都可以得到相同的效果，在此不一一叙述）。
[0023] sf9细胞培养于Grace培养液中，添加15%胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50ug/ ml，转染方法如下：
（a）转染前一天将细胞分到24孔板；
（b）转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500μl培养液；
（c）在50μl无血清、无双抗培养液中分别加入2μl脂质体、5μl前述的重组质粒，室
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