(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.04.30
C N 103751764
A (21)申请号 201310741576.9
(22)申请日 2013.12.27
A61K 38/16(2006.01)
A61P 25/00(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
(71)申请人中国农业大学
地址100193 北京市海淀区圆明园西路2号
(72)发明人杨利峰 赵德明 宋志琦 王运盛
周向梅 尹晓敏 赵化粉
(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人王文君
(54)发明名称
病药物中的应用
(57)摘要
本发明提供BAT3蛋白在制备由朊病毒引起
的神经系统疾病药物中的应用。本发明还提供一
种用于由朊病毒引起的神经系统疾病的药
物，特别是用于由PrP106-126毒性多肽引起
的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分
为BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，
或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸
形成的具有同等功能的氨基酸序列。BAT3蛋白的
表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造 成的凋亡，为进一步阐释该蛋白对朊病毒引起的
神经元损失的作用机制提供了有效而集约的
研究手段，另外也填补了该蛋白在方法方面
的空白。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书8页
序列表6页 附图5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书8页序列表6页 附图5页(10)申请公布号CN 103751764 A
1/1页
1.一种用于由朊病毒引起的神经系统疾病的药物，其特征在于，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.一种用于由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物，其特征在于，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
其中，PrP106-126毒性多肽的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。
3.BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病的药物中的应用，所述BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病是指由朊病毒引起的神经细胞凋亡。
5.BAT3蛋白在制备由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物中的应用，所述BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
其中，PrP106-126毒性多肽的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病是指由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡。
7.一种重组质粒pCMV-HA-BAT3，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
8.含有权利要求7所述重组质粒的转基因细胞系。
9.根据权利要求8所述的转基因细胞系，其特征在于，所述细胞系包括但不限于Hela 细胞系、N2a 细胞系、原代神经元细胞系。权 利 要 求 书CN 103751764 A
BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及蛋白质工程领域，具体地说，涉及BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的应用。
背景技术
[0002] 脂质体（Liposomes）是利用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物，是应用最多的非病毒介导的基因转移系统。脂质体单室脂质体、多室脂质体，含有表面活性剂的脂质体。按性能脂质体可分为一般脂质体（包括单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等）、特殊性能脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按电荷性，脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。脂质体区别于其它普通制剂的一个重要特点是其具有靶向性。脂质体的靶向性分为被动靶向性和主动靶向性，被动靶向性是脂质体进入人体后的自然分布，即静注体内的脂质体主要定位于肝、脾、骨髓、血液中的巨噬细胞等；而主动靶向性是改变脂质体被动靶向性的特点，使其定位于特定的细胞、组织、器官，这受到了脂质体粒子大小及毛细血管种类的限制。脂质体的靶向性可以通过放射性元素标记或高效液相谱分析法检验得以验证。阳性脂质体（cationic liposome）又称阳离子脂质体，正电荷脂质体（Positiveiy charged liposome）是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成。阳性脂质体中使用的中性磷脂成分上与常规脂质体相似，如胆固醇（chol）、磷脂酞胆碱（PC）、磷脂酚乙醇胺（PE）等。阳性成分多为合成的双链季按盐型表面活性剂，具有体外稳定性好，体内可被生物降解的优点。阳性脂质体介导的基因转染作用机制介导转染过程中，阳性脂质体的主要作用在于DNA形成复合物，介导与细胞的作用，并将DNA释放到细胞中，实现基因转染。
[0003] 阳性脂质体作为一种可供选择的基因传递载体具有下列优点：(1)可防止核酸被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中；(2)无毒、无免疫性，具有生物惰性，可生物降解；(3)易于制备，使用方便，可将大的DNA片断转运到细胞中；(4)基因转染率高，100%离体细胞可以瞬间表达外源基因。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供BAT3蛋白在制备用于由朊病毒引起的神经系统疾病的药物中的应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种用于由朊病毒引起的神经系统疾病的药物。[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种用于由朊病毒引起的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白。
[0007] 本发明还提供一种用于由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白。
[0008] 本发明还提供BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病是指由朊病毒引起的神经细胞凋亡。
[0009] 本发明还提供BAT3蛋白在制备由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病是指由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡。[0010] 本发明进一步提供重组
质粒pCMV-HA-BAT3，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。[0011] 本发明还提供含有所述重组质粒pCMV-HA-BAT3的转基因细胞系。所述细胞系包括但不限于Hela细胞系、N2a细胞系、原代神经元细胞系等。
[0012] 本发明中涉及到的BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013] 本发明中涉及到的PrP106-126毒性多肽的氨基酸序列如Seq IDNo.2所示。[0014] 本发明通过构建一套完善的目的基因转移载体系统，在可调控的条件下在需要的时间内表达一定量基因产物——目的蛋白。BAT3蛋白的表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡，为进一步阐释该蛋白对朊病毒引起的神经元损失的作用机制提供了有效而集约的研究手段，另外也填补了该蛋白在方法方面的空白。[0015] 通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-BAT3质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系N2a，Western blot检测转染后BAT3表达量的变化；用PrP106-126神经毒性多肽处理N2a细胞，用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平；Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后胞浆内细胞素c和Bcl-2的变化，进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥的作用机制。
附图说明
[0016] 图1为本发明神经元细胞的鉴定以及证明BAT3蛋白在N2a细胞中的过表达。[0017] 图2为本发明BAT3蛋白在N2a细胞中的过表达情况。
[0018] 图3为本发明BAT3蛋白与全长朊蛋白发生相互作用的情况。
[0019] 图4为本发明用PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元或N2a细胞后，BAT3蛋白从胞核转移到胞浆的情况；其中，A.首先用FITC标记的PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元24h，用免疫荧光染实验证实，多肽刺激之后，BAT3从细胞核转移到胞浆；B和C.进一步用Western blot证实了PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞后，BAT3蛋白从胞核向胞浆转移的情况。
[0020] 图5为本发明BAT3蛋白过表达后可以缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡；其中，A.用TUNEL试验证实了BAT3蛋白过表达之后，与只攻毒组以及转染空载体+攻毒组相比，神经细胞凋亡水平明显下降；B.用Western blot检测BAT3在对应组别中的表达量。
[0021] 图6为本发明用PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞引起细胞素C向胞浆中的释放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下调。
[0022] 图7A为本发明BAT3蛋白过表达后可以抑制细胞素C向胞浆的释放，同时稳定胞浆中Bcl-2抗凋亡蛋白的水平。
[0023] 图7B为本发明实施例中用PrP106-126毒性多肽攻毒之后，BAT3蛋白过表达对细胞素C释放的抑制作用呈剂量依赖性。
具体实施方式
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。[0025] 实施例BAT3蛋白的表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡[0026] 1.材料及来源
[0027] 小鼠神经瘤细胞系N2a（ATC-CCCL-131TM），购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；BAT3鼠源单克隆抗体，细胞素c兔源多克隆抗体购自Santa Cruz公司；HA鼠源单克隆抗体，Bcl-2（P65）兔源多克隆抗体，β-actin兔源多克隆抗体，Lamin B1鼠源单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗,Alexa Fluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自中杉金桥公司；FITC标记的山羊抗兔二抗和Cy5标记的山羊抗兔二抗，兔源TUBB3/betaIII tubulin（神经元标记物）购自博奥森公司，神经元III族-β-Tubulin（Tuj1）抗体，DAPI二氢氯化物和碘化丙啶（PI），免疫荧光染用的免疫固定液、免疫洗涤液，免疫封闭液购自碧云天公司；脂质体转染试剂Lipofectamine2000和无血清培养基Opti-MEM购自Invitrogen公司；胞浆蛋白提取试
剂盒购自武汉博士德公司；多肽：朊蛋白多肽片段(KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG;PrP10 6-126)由上海生物公司合成；FITC标记的PrP106-126毒性多肽购自FANBO生化制剂公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；多肽以2mM浓度溶于PBS中，存储于-20℃；电泳仪：BIO-RAD 美国；电转仪：BIO-RAD美国。
[0028] 2.试验方法
[0029] 2.1Hela细胞和N2a细胞的复苏与培养
[0030] 取出液氮罐中装有N2a细胞的冻存管，立即放入预热至37℃的水浴中并摇动，使管中细胞悬液快速融化，然后低速800r/min离心5min，离心后弃去冻存液，取1ml完全DMEM培养基加至管中反复吹打，吸出吹打后的液体加至培养瓶中，重复冲洗吹打一次。用含
、饱和湿度培养。12h待细胞贴壁后，更20%胎牛血清的完全DMEM培养基4-5ml，37℃、5%CO
2
换新鲜培养液继续培养。
[0031] 2.2原代神经元的分离与培养
[0032] 出生24h内的SD乳鼠75％酒精浸泡消毒5-10min，浸于无菌水中清洗，然后将头剪掉置于无菌平皿中，小剪刀沿大脑中部将皮肤剪开，露出颅骨。眼科剪沿着颅骨中缝剪开，用小止血钳去除颅骨，暴露出大脑皮质和小脑，小心分离出大脑，置（冰上）4℃DMEM液中，在解剖显微镜下分离出双侧大脑皮层，仔细剥除软脑膜和血管，然后沉淀洗涤分离出的组织5-6次（每次静止2min，弃上清），将分离的大脑皮质部分剪碎成1-2mm3的小组织块。将组织悬液置于无菌的瓶中消化（这样消化液在瓶里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决消化不完全的情况），加入终浓度3mg/mL木瓜蛋白酶+适量（0.05mg/ml）DNA酶。37度培养箱消化30-40分钟，每10分钟稍微摇动一下。加入少许血清终止反应，（papain置于37度30min彻底溶解），1000rpm，5min离心弃上清，加入3-4mL DMEM。用大口径吸管（配合头吹打）轻轻吹打组织块使细胞均匀分散为初细胞悬液。对初级细胞悬液经75微米的不锈钢滤网过滤，转移至细胞培养瓶，培养箱培养30min（差速去杂细胞）后，胎盘
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