(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201911191600.X
(22)申请日 2019.11.28
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 110747146 A
(43)申请公布日 2020.02.04
(83)生物保藏信息
CGMCC No. 16131 2018.07.18
(73)专利权人 微康益生菌（苏州）股份有限公司
地址 215000 江苏省苏州市吴江经济技术
开发区龙桥路1033号
(72)发明人 方曙光 吴明科 朱建国 刘春
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
专利代理师 陈小龙(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A61K 35/747(2015.01)A61P 19/06(2006.01)C12R 1/225(2006.01)审查员 苏存生 (54)发明名称具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用(57)摘要本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用。本发明的格氏乳杆菌LG08，已于2018年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其具有优异的核苷及核苷酸降解能力，可分解大部分尿酸合成的 前体，减少机体对尿酸合成前体的吸收，还可直接高效分解进行肠道中的尿酸，并通过降低血清内毒素水平及抑制黄嘌呤氧化酶活性，进一步抑制尿酸的生成
并缓解炎症等副反应。
权利要求书1页 说明书8页序列表2页 附图3页CN 110747146 B 2022.05.27
C N 110747146
B
1.一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08，其特征在于：已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。
2.根据权利要求1所述的格氏乳杆菌LG08，在制备用于缓解高尿酸血症的药物中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物中所包含的格氏乳杆菌LG08为活菌株、干菌株或菌株代谢物。 4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物包括药学上可接受的载体，其剂型为包括片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉中一种或多种的口服制剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 110747146 B
具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用。
背景技术
[0002]近年来，随着人们物质生活水平的不断提高，大众对海鲜、肉类及啤酒等含高嘌呤食物的摄入量不断增加，这在提升舌尖幸福感的同时也带来了众多慢性代谢性疾病，如高尿酸血症。据统计，我国目前高尿酸血症患者大约有1.2亿，接近总人口数的10％，其中，中老年男性和绝经后女性是高发人。正常情况下人体内的尿酸是不断地生成和排泄的，并维持在一定的浓度范围内。然而一旦该平衡被打破，就易引发血液中尿酸含量升高并最终导致高尿酸血症。
[0003]目前，传统的高尿酸血症的方法包括药物、限制饮食等，其中，应用于临床上的药物主要为排尿酸药、抑制尿酸生成药和碱物等，其通过增加尿酸排泄、抑制尿酸生成或碱化尿液等方式来缓解高尿酸症状。但需要指出的是，上述药物存在低耐受性、高药物依赖性及并发症副作用多等问题，成为当前方法特别是药物疗法中亟待解决的问题。在饮食控制方面，由于大多数食品中因含动植物细
胞而含有嘌呤，因此，精确限制嘌呤摄取极其困难，且嘌呤酸摄取的限制易造成营养失衡。此外，嘌呤摄取的限制还需限制次黄苷酸等的摄取，由此削弱了食物的味道，结果导致人们很难长时间遵循嘌呤限制的膳食。因此，寻新型高效的方案已成为目前研究的热点。
[0004]人体内的尿酸，大约70％是通过肾脏排泄，其余部分在人体肠道中排泄或由肠道内菌进行分解。益生菌作为肠道中重要的生理菌，已成为基于微生态改善高尿酸的重要开发方向。目前，针对降尿酸益生菌的开发主要集中在筛选可高效代谢尿酸合成前体核苷或核苷酸的菌株上，即通过分解食物中的尿酸合成前体核苷或核苷酸，减少人体对上述前体物质的吸收，从而减少人体内尿酸的合成。如大连医科大学选育获得了一株短乳杆菌DM9218及其重组蛋白(中国专利公开号CN106834162A)，其对肌苷和鸟苷的分解率分别为99.31％和99.64％。坪井洋等(中国专利申请号201110453933.2)筛选出可分别降解肌苷和鸟苷的口乳杆菌OLL2779和格氏乳杆菌OLL2959，经大鼠实验验证发现上述两株菌具有抑制血清尿酸值上升的作用。但是，其代谢产物主要为次黄嘌呤和鸟嘌呤，上述两种物质进入机体后仍可经由黄嘌呤最终生成尿酸，因此并未从根本上消除过量摄入嘌呤可能引起的尿酸
《微生物学通报》2018年第增加风险。金(降血尿酸益生菌株的筛选和降血尿酸机理的探索，
8期1757‑1769页)等则在此基础上，进一步拓宽降解的底物范围，选育出一株不仅可高效降解核苷(腺苷和鸟苷)，还可高效降解核苷酸(腺苷酸和鸟苷酸)的干酪乳杆菌ZM15。[0005]上述菌株均可一定程度上缓
解高尿酸血症症状。但需要指出的是，食物中含有的可合成尿酸的前体众多，如一些改善风味的鲜味剂中不仅含有5’‑鸟苷酸二钠，还含有5’‑肌苷酸二钠，而上述菌株均未见其对降解肌苷酸的作用有所报道。此外，尿酸在人体自身代谢过程中也会不断生成，上述菌株虽可高效代谢部分尿酸合成前体，却未报道上述菌株是
否可降解已生成的尿酸，这直接影响其对因尿酸排泄减少而造成的高尿酸血症的缓解作用，如因肾小球滤过减少、肾小管重吸收的增加以及肾小管分泌减少等造成的原发性高尿酸血症，而这类高尿酸血症占到了原发性高尿酸血症的90％左右。
发明内容
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用；该格氏乳杆菌LG08具有优异的核苷及核苷酸降解能力，可分解大部分尿酸合成的前体，减少机体对尿酸合成前体的吸收，还可直接高效分解进行肠道中的尿酸，并通过降低血清内毒素水平及抑制黄嘌呤氧化酶活性，进一步抑制尿酸的生成并缓解炎症等副反应。
[0007]本发明第一方面提供一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌，命名为LG08，已于2018年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008]本发明第二方面提供一种格氏乳杆菌LG08在制备用于缓解高尿酸血症的药物中的应用。
[0009]进一步的，所述药物中所包含的格氏乳杆菌LG08为活菌株、干菌株或菌株代谢物。[0010]进一步的，所述药物包括药学上可接受的载体，其剂型为包括片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉中一种或多种的口服制剂。
[0011]借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0012]1)根据基本的益生特性及对核苷(腺苷、鸟苷和肌苷)、核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸和肌苷酸)及5’‑鸟苷酸二钠等的降解作用，筛选具有优异核苷及核苷酸降解性能的益生菌。筛选获得的LG08细胞质对腺苷、鸟苷和肌苷的降解速率分别为3.91mmol/g/h、4.04mmol/g/ h和3.83mmol/g/h，对腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’‑鸟苷酸二钠的降解速率分别为4.29mmol/g/h、4.56mmol/g/h、4.32mmol/g/h和3.92mmol/g/h。
[0013]2)对降解尿酸性能进行测试，结果表明格氏乳杆菌LG08对尿酸的降解速率达1.36mmol/g/h。
[0014]3)在Caco‑2细胞模型中评价粘附性能，结果表明格氏乳杆菌LG08对Caco‑2细胞的粘附性能可达15.2个/细胞。
[0015]4)利用体外实验进行菌株胃酸及胆盐耐受性能评价，格氏乳杆菌LG08在pH 3.0条件下胁迫3h存活率可达79.1％，在0.3％猪胆盐胁迫3h后存活率可达82.6％。
[0016]5)以给大鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立高尿酸血症模型。造模成功后模型组血尿酸水平达241.13μmol/L，灌胃LG08发酵液28天，LG08干预组大鼠血尿酸水平显著降低。此外，血清内毒素降低49％，黄嘌呤氧化酶活性降低26.4％。
[0017]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0018]图1是本发明中不同乳酸菌菌株在模拟胃液中的存活率；
[0019]图2是本发明中不同乳酸菌菌株在模拟胆盐液中的存活率；
[0020]图3是本发明中格氏乳杆菌LG08对尿酸的降解能力；
[0021]图4是本发明中不同干预方式对血尿酸水平的影响；
[0022]图5是本发明中格氏乳杆菌LG08干预对血清内毒素的影响；
[0023]图6是本发明中格氏乳杆菌LG08干预对黄嘌呤氧化酶活性的影响。
具体实施方式
[0024]下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0025]实施例一具有降解尿酸作用的菌株筛选
[0026]1)菌株筛选
[0027]提取来自中国广西壮族自治区河池市巴马镇健康老人粪便(采集前人均未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无胃肠病史)的稀释液5mL，10倍系列稀释至10‑6，每个稀释浓度取200μL涂布于选择性MRS培养基，37℃厌氧培养48‑72h，分离获得平板上不同的单菌落。用灭菌后的接种环挑取前述不同单菌落在MRS固体培养基上划线纯化，37℃厌氧培养48h，得到纯乳酸菌菌株共9株，分别命名为L1‑L9。
[0028]2)分离菌株对模拟胃液的耐受能力分析
[0029]收集培养后菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体重悬于生理盐水中，按活菌数109CFU/mL接入到pH 3.0的模拟胃液中，37℃培养3h后进行活菌数检测并计算存活率，其存活率如图1所示，不同菌株在模拟胃液中的存活率差异较大，其中菌株L8在模拟胃液中的存活率最高，达79.1％。
[0030]3)分离菌株对模拟胆盐液的耐受能力分析
[0031]收集培养后的菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体重悬于生理盐水中，按活菌数109CFU/mL接入到添加0.3％猪胆盐的模拟液中，37℃培养3h后进行活菌数检测并计算存活率，其存活率如图2所示。菌株L5、L6和L8在模拟胆盐液中的存活率较高，分别为76.5％、75.1％和82.6％。
[0032]4)分离菌株对Caco‑2细胞的粘附性能分析
[0033]将培养后的菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体用PBS缓冲液洗涤3次，再用DMEM调节菌液浓度至109CFU/mL，将菌悬液加入到已培养好的Caco‑2单层细胞中，37℃共培养2h，再用甲醇固定30min后革兰氏染，在电镜下观察20个视野100个细胞，计算不同乳酸菌对细胞的粘附力，其中菌株L8对细胞粘附性能最佳，达15.2±0.5个/细胞。
[0034]表1菌株对Caco‑2细胞的粘附性能
[0035]菌株粘附力(个/细胞)
L1 5.1±0.1
L29.3±0.3
L313.2±0.5
L49.1±0.4
L514.3±0.3
L611.7±0.2
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