(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010986431.5
(22)申请日 2020.09.18
(71)申请人 北京百迈客生物科技有限公司
地址 101300 北京市顺义区南法信镇顺平
路南法信段9号院1幢5层508室
(72)发明人 郑洪坤 毕经德 李汉洲 赵庆
张雪川 王瑞
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 钱云
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6806(2018.01)
C12Q 1/6869(2018.01)
C40B 50/06(2006.01)
(54)发明名称一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，所述构建方法为：获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。本发明主要改进三代测序的建库流程，通过将微生物16S 全长的扩增产物串联处理，得到含有多个微生物16S序列的扩增子，相较于串联处理前，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本，有效CCS数提高了一倍以上，为三代全长微生物多样性在科研领域的大规模应用起到了催化 作用。
权利要求书1页 说明书8页序列表1页CN 112176030 A 2021.01.05
C N 112176030
A
1.一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括：
获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode 序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述barcode序列为7-24bp的barcode 序列，优选为12-18bp的barcode序列，和/或，所述串联接头序列为2-10bp串联接头序列，优选为2-8bp的串联接头序列，更优选为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的串联接头序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述串联处理为对于微生物的全长扩增产物先通过USER酶切处理，得到含有粘性末端的酶切产物，纯化后再通过T4连接酶对所述酶切产物进行串联、纯化得到串联产物。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述USER酶切处理的反应体系为：扩增产物2～3μg、10×CutSmart buffer 4～6μL、USER Enzyme 2.5～3.5μL，余量为ddH 2O补足50μL，和/或，
所述USER酶切处理的反应条件为在36～38℃下反应30～60min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物为对多个待测样品进行扩增得到所有微生物16S全长的扩增产物，对所有待测样品进行检测去除低质量扩增产物，所述低质量扩增产物为琼脂糖凝胶电泳结果中未出现目的条带或非特异性条带亮度超过目标条带的扩增产物。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述对多个待测样品进行扩增的扩增体系中使用的DNA聚合酶为KOD FX
Neo和
Hot Start High -Fidelity DNA Polymerase；所述KOD FX Neo和Hot Start High -Fidelity DNA Polymerase的用量优选与所述扩增体系的体积比为0.3～0.5∶20和0.4～0.6∶20。
7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述建库包括：将所述串联产物浓缩至25～35μL进行切胶片筛并纯化，再进行DNA损伤修复、连接SMRT接头和纯化。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述切胶片筛为筛选长度范围在2-6个微生物16S全长的串联产物。
9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法，其特征在于，在所述建库后还包括：
对文库进行2100检测，当检测结果中文库大小的主峰在3K以上，且文库浓度>15ng/μL 时，判断为合格的文库。
10.权利要求1-9任一项所述的构建方法在提高三代测序效率中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112176030 A
一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及三代测序技术领域，尤其涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用。
背景技术
[0002]微生物落结构多样性一直是现有技术研究的热点，微生物“个头小，本领强”，从人体的皮肤、口腔、胸腔、阴道到肠道、粪便，无处不在，又称为“人体第二基因组”，在人体中发挥着巨大的作用。还广泛存在于土壤、水体、发酵液、植物、空气等环境样本中，它们推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。
[0003]传统研究中，是将环境样本中的微生物进行分离培养，提取已经分离培养出来的每一个纯菌的DNA，针对原核微生物的“身份证”16S rDNA区设计特异性的引物(细菌：27F和1492R)进行一代Sanger测序，通过得到的16S全长从而进行菌种鉴定，然后进行物种多样性的统计。一代测序的弊端是只能针对环境样本中可分离培养的菌进行微生物多样性的分析，不能检测出不可培养的微生物，通量低。随着高通量测序技术的发展，Illumina测序技术兴起，Illumina测序平台有读长的限制，二代微生物多样性测
序一般使用PE250或PE300双端测序，因此只能针对细菌16S rDNA的某一段可变区(如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，等)进行测序。提取环境样本中总的微生物DNA，设计特异性引物进行扩增，混样建库测序，可得到环境样本中可培养和不可培养微生物的物种多样性，但是通过某一两个可变区域预测物种的多样性，还是存在一定的误差，一般只能承诺注释到“属”水平。并且对引物特异性要求非常高，不同的样本以及不同的物种对不同的引物都会有偏好性。
[0004]因此，现有技术中多个公司推出Pacbio三代全长微生物多样性产品，Pacbio全长微生物多样性测序技术结合了一代Sanger测序的读长优势和Illumina测序的高通量优势，将细菌16S全长完全测通，在细菌落结构分析中具有：覆盖度广、读长长、通量高、物种注释准，承诺注释到“种”水平，种水平注平均注释率≥60％等产品优势。
发明内容
[0005]为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，具体通过串联微生物16S扩增子进行建库，应用于三代测序时，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本。
[0006]第一方面，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，包括：[0007]获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述
串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。
[0008]现有技术中，Pacbio测序过程中，芯片上的每个检测单元ZMW孔通常对应一个扩增子分子，本发明通过串联处理将多个微生物16S全长的扩增产物连接成一个扩增子，使得每个检测单元ZMW孔可以一次完成多个微生物16S全长分子的测序，能够有效提高单芯片混样
个数，降低单个样本的检测成本。
[0009]进一步地，所述barcode序列为7-24bp的barcode序列，优选为12-18bp的barcode 序列，barcode序列为测序时为每个微生物16S区域连接的条形码序列，用于和其他微生物16S区域的测序结果进行区分。
[0010]进一步地，所述串联接头序列为2-10bp串联接头序列，优选为2-8bp的串联接头序列，更优选为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的串联接头序列。正向扩增引物连接串联接头序列5’-agccgu-3’；反向扩增引物连接串联接头序列5’-acggcu-3’，二者为反向互补序列。
[0011]进一步地，所述串联处理为对于微生物的全长扩增产物先通过USER酶切处理，得到含有粘性末端的酶切产物，纯化后再通过T4连接酶对所述酶切产物进行串联、纯化得到串联产物。
[0012]本发明采用串联接头序列在微生物16S全长扩增产物中加上“U碱基”，后续通过USER酶针对“U碱
基”进行酶切再通过T4连接酶进行连接可以有效防止在酶切时切掉待测序的片段，造成微生物16S片段的丢失。并且通过USER酶切处理和T4连接酶进行串联处理可以提高含有多个微生物16S全长的扩增子比例，从而更显著地提高单芯片混样个数。除此之外，本发明的串联处理流程通过采取粘性末端连接的方式有效提升串联效率，相比于平末端连接，连接效率提升30％以上
[0013]进一步地，所述USER酶切处理的反应体系为：
[0014]扩增产物2～3μg、10×CutSmart buffer 4～6μL、USER Enzyme2.5～3.5μL，余量为ddH2O补足50μL；所述USER酶切处理的反应条件为在36～38℃下反应30～60min。[0015]进一步地，所述获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物为对多个待测样品进行扩增得到所有微生物16S全长的扩增产物，对所有待测样品进行检测去除低质量扩增产物，所述低质量扩增产物为琼脂糖凝胶电泳结果中未出现目的条带或非特异性条带亮度超过目标条带的扩增产物。
[0016]进一步地，所述对多个待测样品进行扩增的扩增体系中使用的DNA聚合酶为KOD FX Neo和Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase；所述KOD FX Neo和
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase的用量优选与所述扩增体系的体积比为0.3～0.5∶20和0.4～0.6∶20。
[0017]进一步地，所述建库包括：将所述串联产物浓缩至25～35μL进行切胶片筛并纯化，再进行DNA损伤修复、连接SMRT接头和纯化。
[0018]进一步地，所述切胶片筛为筛选长度范围2-6个微生物16S全长扩增子的串联产物。例如：使用sage science公司Blue Pippin自动切胶仪Pippin Gel Cassette(0.75％Agarose Dye-Free 40μL EM)和S1 Marker进行切胶片筛，参数设置3-10K。
[0019]进一步地，在所述建库后还包括：
[0020]对文库进行2100检测，当检测结果中文库大小的主峰在3K以上，且文库浓度> 15ng/μL时，判断为合格的文库。
[0021]本发明进一步提供所述构建方法在提高三代测序效率中的应用。
[0022]本发明具备如下有益效果：本发明开发的细菌16S全长串联建库方式将多个不同的16S扩增子串联后再进行测序的方法可以得到含有多个微生物16S全长的扩增子，在进行
Pacbio时，够有效提高单芯片混样个数，从而大大降低单个样品的测序成本，为三代全长微生物多样性在科研领域的大规模应用起到了催化作用。
具体实施方式
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]实施例1一种微生物多样性全长16S扩增子串联测序文库的构建方法
[0025]本实施例提供一种微生物多样性全长16S扩增子串联测序文库的构建方法，具体如下：
[0026]1、微生物16S全长扩增产物的制备：
[0027] 1.1微生物全长16S扩增
[0028] 1.1.1在96孔PCR板里按表1配制反应体系，每个样品对应一对barcode引物，barcode引物5’末端连接有串联接头序列，具体地正向扩增引物连接串联接头序列5’-agccgu-3’；反向扩增引物连接串联接头序列5’-acggcu-3’，涡旋混匀后短暂离心，使反应液集中在反应孔的底部。
[0029]表1全长16S目标区域扩增反应体系
[0030]
[0031]
[0032] 1.1.2将96孔PCR板置于PCR仪中，关闭热盖，运行表2中的扩增程序进行16S全长区域的扩增。
[0033]表2全长16S目标区域扩增程序
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