(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010365454.4
(22)申请日 2020.04.30
(71)申请人 北京鸿测科技发展有限公司
地址 102600 北京市大兴区北京经济技术
开发区经海五路58号院6幢4层、7层
(72)发明人 胡梦莹 王志斌 张连中 高春
牛策 秦柳 李娜娜
(74)专利代理机构 北京维正专利代理有限公司
11508
代理人 赵万凯
(51)Int.Cl.
C12Q 1/14(2006.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12R 1/445(2006.01)
C12R 1/385(2006.01)
C12R 1/125(2006.01)C12R 1/725(2006.01)C12R 1/685(2006.01)
(54)发明名称黄连配方颗粒的微生物限度检查方法(57)摘要本发明公开了一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，包括以下步骤：S1分别配制金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉的菌悬液；S2供试液的制备：配制含有3%组氨酸的供试液；S3需氧菌总数计数方法适用性试验；S4霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验；S5大肠埃希菌检查方法适用性试验；其中限度检测标准为：1 g供试品中，需氧菌总数≤103 cfu，霉菌和酵母菌总数≤102 cfu，大肠埃希菌不得检出。本发明的方法可用于黄连配方颗粒中微生物限度检查，具有有效地消除样品的抑菌性、简化检查过程、减少试剂用量、高效检测 出黄连配方颗粒中微生物的优点。权利要求书2页 说明书16页CN 111690709 A 2020.09.22
C N 111690709
A
1.一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1菌悬液的配制：分别配制金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉的菌悬液；
S2供试液的制备：
S2-1取黄连配方颗粒10 g，加含3%组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液；
S2-2取1:10的供试液20 ml，加含3%组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80 ml，即为1:50的供试液；
S2-3取1:10的供试液10 ml，加含3%组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 ml，即为1:100的供试液；
S3需氧菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的需氧菌总数；
S4霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的霉菌和酵母菌总数；
S5大肠埃希菌检查方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组以及阴性对照组培养物，随后接种于相应培养基中，观察结果。
2.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：
S3-1试验组：分别取五份1:100的供试液，每份供试液的体积为1 ml，分别加置于100 ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤法过滤后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗多次，在最后一次冲洗液中分别于五份供试液中加入一种1 ml含菌量10-100 cfu的试验菌液，然后取下滤膜并贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，在33℃的条件下培养3天；其中，五份供试液中加入的试验菌分别为：金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉；
S3-2供试品组：取1:100的供试液1 ml，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作；
S3-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:100的供试液同试验组操作；
S3-4稀释剂对照组：取相应量的含3%的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作。
3.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述步骤S4包括以下
步骤：
S4-1试验组：与步骤S3-1的不同之处在于，供试液选取1:50的供试液，试验菌液为白念珠菌试验菌液和黑曲霉试验菌液，取下滤膜后贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20-25℃的条件下培养5天；
S4-2供试品组：取1:50的供试液1ml，以稀释液代替菌液同步骤S4-1的试验组操作；
S4-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:50的供试液，其它同试验组操作；
S4-4稀释剂对照组：取相应量的含3%的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替
供试液同试验组操作。
4.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括以下步骤：
S5-1菌液制备：制备大肠埃希菌的菌悬液；
S5-2试验组：取1:10的供试液10 ml，加置500 ml含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1 ml含菌量为10-100 cfu的大肠埃希菌菌液，注入上述500 ml含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，于33℃培养18-24 h，观察；
S5-3供试品组：取1:10的供试液10 ml，加置500 ml含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1 ml稀释液代替菌液同试验组操作，观察；
S5-4阴性对照组：取相应量的含3%的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作；
S5-5取上述培养物各1 ml至100 ml麦康凯液体培养基中，43℃的条件下培养24-48 h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，33℃的条件下培养18-72 h，观察结果。
5.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述金黄葡萄球菌菌悬液的制备包括以下步骤：接种金黄葡萄球菌于10 ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24 h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml含菌数为10-100 cfu的菌悬液。
6.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌菌悬液的制备包括依以下步骤：接种铜绿假单胞菌于10 ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24 h后，用pH
7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml含菌数为10-100 cfu的菌悬液。
7.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌悬
液的制备包括依以下步骤：接种枯草芽孢杆菌于10 ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24 h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml含菌数为10-100 cfu的菌悬液。
8.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述白念珠菌菌悬液的制备包括以下步骤：接种白念珠菌于10 ml的沙氏葡萄糖液体培养基中，在20-25℃的条件下培养18-24 h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml 含菌数为10-100 cfu的菌悬液。
9.根据权利要求1所述的一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其特征在于，所述黑曲霉菌悬液的制备包括以下步骤：取经20-25℃培养5-7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3-5 ml的含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml含孢子数为10-100 cfu的孢子悬液。
黄连配方颗粒的微生物限度检查方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及中药检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法。
背景技术
[0003]黄连具有清热燥湿，泻火解毒的功效，常用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮等症状，因此黄连被制成中药制剂进行相关疾病的。
[0004]黄连常被制作成颗粒状，在进入市场流通之前，根据由国家食品药品监督管理总局公告发布的《中华人民共和国药典》的相关要求，要对黄连进行微生物限度检查。目前，对于药物中微生物限度检查的研究较多。
[0005]申请号为201810077354.4的发明专利公开了一种富马酸比索洛尔胶囊的微生物限度检查方法，所述的富马酸比索洛尔胶囊的微生物限度检查方法，步骤如下：(1)菌液制备；(2)供试液制备：取富马酸比索洛尔胶囊供试品10g，置于无菌均质袋中，加100ml的45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，用均质器拍打1min，摇匀，作为1：10的供试液；(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定；(4)大肠埃希菌的检查。
[0006]上述是对药物中进行微生物限度检查的常规方法，但是目前对于黄连中的微生物限度检查的方法还未被公开。而根据《中华人民共和国药典》中记录的中药中微生物限度检查方法，其中需要在检测过程中添加有效的中和剂，该有效的中和剂能够和黄连中干扰物结合，消除黄连样品的抑菌性，从而实现
有效检测出黄连中微生物限度，但是《中华人民共和国药典》并未对黄连中能够消除干扰物的中和剂或灭活方法进行记载，而干扰物会直接影响黄连中微生物的限度检查结果。因此，根据《中华人民共和国药典》的相关记录无法准确检测出黄连中的微生物限度。
发明内容
[0007]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其采用一种中和剂，具有有效地消除样品的抑菌性、简化黄连中微生物限度检查的过程、减少试剂用量、高效检测出黄连配方颗粒中微生物的优点。
[0008]为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，包括以下步骤：
S1菌悬液的配制：分别配制金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉的菌悬液；
S2供试液的制备：
S2-1取黄连配方颗粒10g，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，
振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液；
S2-2取1:10的供试液20ml，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，即为1:50的供试液；
S2-3取1:10的供试液10ml，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:100的供试液；
S3需氧菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的需氧菌总数；
S4霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的需氧菌总数；
S5大肠埃希菌检查方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组以及阴性对照组培养物，随后接种于相应培养基中，观察结果。
[0009]通过采用上述技术方案，由于在供试液中加入有效地中和剂组氨酸，组氨酸与黄连中的有效成分结合，消除了在黄连配方颗粒的微生物限度检查中黄连配方颗粒里的干扰物对于检查结果的影响，使得依据上述的方法能够更加准确地检查出黄连配方颗粒中存在的微生物，保证了产品的质量。
[0010]同时，在进行黄连配方颗粒的微生物限度检查中，只选用了一种中和剂(组氨酸)就实现了微生物检
查要求，减少多个中和剂使用的复杂性、减少薄膜过滤的冲洗次数，进而使得试验中使用的培养基及试剂减少，检查过程更加简单。
[0011]进一步地，所述步骤S3包括以下步骤：
S3-1试验组：分别取五份1:100的供试液，每份供试液的体积为1ml，分别加置于100ml 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤法过滤后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗多次，在最后一次冲洗液中分别于五份供试液中加入一种1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，然后取下滤膜并贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，在33℃的条件下培养3天；其中，五份供试液中加入的试验菌分别为：金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉；S3-2供试品组：取1:100的供试液1ml，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作；
S3-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:100的供试液同试验组操作；
S3-4稀释剂对照组：取相应量的含3％的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作。
[0012]通过采用上述技术方案，以简单高效的步骤进行需氧菌总数计数方法适用性试验，获得准确有效的试验结果，提高方法的适用性。
[0013]进一步地，所述步骤S4包括以下步骤：
S4-1试验组：与步骤S3-1的不同之处在于，供试液选取1:50的供试液，试验菌液为白念珠菌试验菌液和黑曲霉试验菌液，取下滤膜后贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20-25℃的条件下培养5天；
S4-2供试品组：取1:50的供试液1ml，以稀释剂代替菌液同步骤S4-1的试验组操作；
S4-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:50的供试液，其它同试验组操作；
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