(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011059096.0
(22)申请日 2020.09.30
(71)申请人 武汉儿童医院
地址 430016 湖北省武汉市江岸区香港路
100号
(72)发明人 徐佳 肖晗 杨渊 高雯琪
龚红建
(74)专利代理机构 武汉臻诚专利代理事务所
(普通合伙) 42233
代理人 胡星驰
(51)Int.Cl.
B01J 20/22(2006.01)
B01J 20/28(2006.01)
B01J 20/30(2006.01)
C12N 15/10(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种氨基磁珠、其制备方法及
团，磁纳米颗粒表面键合氨基密度大于0.18μ
mol/mg。其制备方法包括以下步骤：(1)制备二氧
化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；
(2)制备前体分散液；(3)发生烷基化反应，洗涤
烘干后获得所述氨基磁珠。所述氨基磁珠用于全
和检测之用。权利要求书2页 说明书10页 附图1页CN 112121768 A 2020.12.25
C N 112121768
A
1.一种氨基磁珠，其特征在于，包括二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒，其表面共价接枝有富氨基基团，磁纳米颗粒表面键合氨基密度大于0.18μmol/mg。
2.如权利要求1所述的氨基磁珠，其特征在于，所述富氨基基团，为C3以上的直链。
3.如权利要求2所述的氨基磁珠，其特征在于，所述富氨基基团为-CH2NH-C2H5NH-C2H5NH2。
4.如权利要求1所述的氨基磁珠，其特征在于，所述四氧化三铁纳米颗粒粒径≤30nm，所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒粒径在35nm-50nm之间。
5.如权利要求1至4任意一项所述的氨基磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团。
6.如权利要求5所述的氨基磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在2-7mg/mL，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；
(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂4-10mmol、以及氨水0.15-0.2mL，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；
(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温至100℃反应8～12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。
7.如权利要求5所述的氨基磁珠的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶液优选为二甲基甲酰胺(DMF)、和/或甲苯；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间。
8.如权利要求5所述的氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：
取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.4-0.6g的正硅酸四乙酯、以及1-2.5mL的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒；所述纳米四氧化三铁颗粒粒径≤30nm优选20nm，所述醇水溶液中乙醇与水体积比为3:1-4:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.1-0.5g/mL之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、60℃～100℃反应8～12h。
9.如权利要求1至4任意一项所述的氨基磁珠的应用，其特征在于，应用于全血DNA提取。
10.如权利要求9所述的氨基磁珠的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向经蛋白酶预处理的全血样本中加入DNA结合液和本发明提供的氨基磁珠，混匀反应10min-40min，固液分离获得吸附有DNA的氨基磁珠；每200μL全血样本对应使用所述氨基磁珠2mg-3mg；
S2、采用乙醇的水溶液进行洗涤；所述乙醇的水溶液1mL-3mL，浓度在70-75v/v％之间，洗涤次数大于等于两次，获得磁珠-DNA复合物；所述磁珠-DNA复合物可直接用于扩增、测序，也可以进行步骤S3洗脱；
S3、向所述磁珠-DNA复合物加入洗脱液，将DNA洗脱，固液分离收集液相获得提取的全血DNA样本。
一种氨基磁珠、其制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种氨基磁珠、其制备方法及应用。
背景技术
[0002]基因组DNA携带有生命活动的全部遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。
从全血中提取DNA是获得生物基因组遗传信息较为简单的方法，也是进行基因相关性研究的重要手段和技术。DNA提取的质量和产量直接影响着后续实验的准确性。纳米磁珠是由磁性材料与高分子材料通过化学或者物理键合的方法制备而成的一种性能优越的功能材料。
[0003]纳米磁珠法属于固相萃取法，磁性纳米材料的使用使得固相分离过程变得更为简便与高效。磁性纳米颗粒具有比表面积大、表面活性高和生物相容性好等优良特性，能够充分地与DNA相互作用，并在外加磁场作用下高效地进行固液分离，从而提高DNA的提取效率。由于DNA核酸骨架上具有磷酸基团，带有负电荷，因此不需要任何额外的结合剂，DNA就可以有效的吸附在带正电荷基团修饰的磁珠表面，并且吸附的DNA被保护免于酶切割。基于这些优势，磁珠法DNA提取试剂盒可用于临床疾病诊断、环境微生物检测、食品安全检测、实验室研究等多种领域。
[0004]氨基磁珠即为表面修饰有氨基官能团且具有超顺磁性的磁性微粒，是一种被广泛应用的功能性生物磁珠，主要用于免疫磁珠的制备。在一定条件下，氨基磁珠通过交联试剂(如戊二醛等)的介导，可与蛋白配体(如抗原、抗体等)、寡核苷酸探针等生物分子共价偶联，这类偶联有生物配体的氨基磁珠即为免疫磁珠。氨基磁珠被广泛应用于蛋白质的分离提纯、细胞分离、酶的固定、免疫分析等多个领域。
[0005]氨基磁珠表面接枝的氨基基团，可以通过静电相互作用与DNA分子上的磷酸基团相互作用，达到吸附目的，在温和的吸附条件可以与DNA下游分析条件较好的兼容，减少了纯化步骤。因此，为了提高DNA捕获的效率，应尽量提高磁性纳米颗粒表面氨基修饰的密度。
发明内容
[0006]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种氨基磁珠、其制备方法及应用，其目的在于通过进一步提高氨基磁珠表面键合氨基密度并通过富氨基基团的结构，提高氨基磁珠对DNA特异性的亲和能力，从而简化提取步骤、降低提取难度、缩短提取时间，由此解决现有技术的技术提取时间较长、步骤繁琐、回收率不高的问题。
[0007]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种氨基磁珠，包括二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒，其表面共价接枝有富氨基基团，磁纳米颗粒表面键合氨基密度大于0.18μmol/mg。
[0008]优选地，所述氨基磁珠，其所述富氨基基团，为C3以上的直链。
[0009]优选地，所述氨基磁珠，其所述富氨基基团为-CH2NH-C2H5NH-C2H5NH2。
[0010]优选地，所述氨基磁珠，其所述四氧化三铁纳米颗粒粒径≤30nm，所述二氧化硅包
被的四氧化三铁纳米颗粒粒径在35nm-50nm之间。
[0011]按照本发明的另一个方面，提供了所述的氨基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：[0012]将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团。
[0013]优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
[0014](1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在2-7mg/mL，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；
[0015](2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂4-10mmol、以及氨水0.15-0.2mL，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；
[0016](3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温至100℃反应8～12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。
[0017]优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其步骤(1)所述有机溶液优选为二甲基甲酰胺(DMF)、和/或甲苯；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间。[0018]优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：
[0019]取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.4-0.6g的正硅酸四乙酯、以及1-2.5mL的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径≤30nm优选20nm，所
述醇水溶液乙醇与水体积比为3:1-4:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.1-0.5g/mL之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、60℃～100℃反应8～12h。
[0020]按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的氨基磁珠的应用，其应用于全血DNA 提取。
[0021]优选地，所述氨基磁珠的应用，其包括以下步骤：
[0022]S1、向经蛋白酶预处理的全血样本中加入DNA结合液和本发明提供的氨基磁珠，混匀反应10min-40min，固液分离获得吸附有DNA的氨基磁珠；每200μL全血样本对应使用所述氨基磁珠2mg-3mg；
[0023]S2、采用乙醇的水溶液进行洗涤；所述乙醇的水溶液1mL-3mL，浓度在70-75v/v％之间，洗涤次数大于等于两次，获得磁珠-DNA复合物；所述磁珠-DNA复合物可直接用于扩增、测序，也可以进行步骤S3洗脱；
[0024]S3、向所述磁珠-DNA复合物加入洗脱液，将DNA洗脱，固液分离收集液相获得提取的全血DNA样本。
[0025]总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
[0026]本发明提供的氨基磁珠，表面键合氨基密度进一步提高，吸附DNA的浓度和纯度都得到明显提供，具有良好的回收率。
[0027]本发明提供的氨基磁珠应用全血DNA提取，能够一次性提取大量DNA样本供扩增和
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