(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210175883.4
(22)申请日 2022.02.25
(71)申请人 于荣敏
地址 511486 广东省广州市番禺区新造镇
暨南大学番禺校区药学院314室
(72)发明人 于荣敏 朱建华 欧筱争
(51)Int.Cl.
C12N 5/04(2006.01)
A61K 36/24(2006.01)
A61K 9/00(2006.01)
A61P 37/02(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
A61K 135/00(2006.01)
(54)发明名称
疫调节方面的应用
(57)摘要
本发明涉及具有免疫活性的长春花外泌体
纳米囊泡及其制备方法，所述包括长春花外泌体
纳米囊泡包括长春花叶片来源外泌体样纳米囊
泡、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊
泡、长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊
泡、长春花茎来源外泌体样纳米囊泡。本发明提
取得到的长春花植物来源外泌体囊泡能够人工
模拟消化系统中维持稳定，并在强酸强碱及酶消
化调节下依然发挥免疫调节活性。权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 114540270 A 2022.05.27
C N 114540270
A
1.一种具有免疫活性的长春花外泌体纳米囊泡，包括长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡、长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡；长春花茎来源外泌体样纳米囊泡。
2.一种包含权利要求1所述的长春花外泌体纳米囊泡以及药学上可接受载体的药物组合物。
3.如权利要求1、2所述的长春花外泌体纳米囊泡在制备用于免疫调节活物的用途；优选地，所述药物组合物在制备用于辅助直肠癌药物的用途。
4.如权利要求1‑3任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其特征在于，长春花外泌体纳米囊泡有载药功能，可以进行跨物种的通讯和调控。
5.如权利要求1‑4任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其特征在于，所述长春花外泌体纳米囊泡在制备无需肠溶包衣的普通口服药物制剂的用途，能够耐受强酸、强碱、以及耐受RNA酶、DNA酶以及蛋白酶的消化而不失去活性。
6.如权利要求1‑5任一项所述长春花外泌体纳米囊泡包括长春花叶片来源外泌体纳米囊泡和长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡。
7.如权利要求1‑6任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其中长春花叶片来源的外泌体纳米囊泡制备方法如下：
1)长春花叶片的酶解：采摘新鲜的长春花叶片，冲洗擦干。配制含有纤维素酶(每100毫升3克)和果胶酶(每100毫升0.2克)，pH在5.75～5.80之间的酶解液。每2g叶子加入100ml酶解溶液，并在25℃下，在摇床上以100rpm的速度在黑暗中孵育至少12h。静置，留取上层液体，以1000rpm离心20min除去杂质。然后在4℃条件下10000rpm离心40min，重复离心3次，取上清液，用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。
2)一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得CLEN。
3)CLEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对CLEN 进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在‑80℃环境中储存直至使用。
8.如权利要求1‑7任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡在制备用于肠溶包衣药物口服制剂的用途。
9.如权利要求8所述长春花外泌体纳米囊泡包括长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡和长春花茎来源外泌体样纳米囊泡。
权 利 要 求 书1/1页CN 114540270 A
一种长春花来源外泌体纳米囊泡及其在免疫调节方面的应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的长春花植物来源纳米囊泡。
背景技术
[0002]长春花是夹竹桃科多年生草本植物，广泛分布于长江以南地区，是常见的行道植物，花期长，一年四季均可种植。长春花中含有的吲哚萜类生物碱被发现具有优良的抗肿瘤活性，目前已上市并用于临床肿瘤的有长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨等。但是，长春花生物碱类药物毒性较强，其注射剂经静脉注射给药后可引起周围静脉炎，还可引发恶心呕吐、神经毒性反应、骨髓抑制等不良反应。长春花生物碱类药物的毒副作用很大地限制了其在临床上的应用。
[0003]外泌体是真核细胞多囊体和质膜融合后释放到细胞外的纳米囊泡，可以长时间留在体循环中，具有良好的生物相容性和低免疫原性。此外，外泌体作为一种膜囊泡结构对亲脂性化合物及生物大分子具有亲和性，可以将药物分子包裹于囊泡之中，是一种良好的药物投递系统。近年来，许多研究人员从肿瘤细胞、干细胞、巨噬细胞等中提取具有良好生物活性的外泌体，并对其进行人工修饰，以实现精准医疗和药物靶向投递。然而，外泌体始终面临组织培养困难、提取成本高、稳定性较差的问题，难以实现最终的产业化和临床应用。[0004]目前科学届的主要研究对象为动物来源外泌体。植物外泌体研究有限，与动物来源外泌体相比，两者种属差异大，即使同为植物来源外泌体，也需要重新建立新的研究体系，目前没有长春花外泌体纳米囊泡的公开报告。
发明内容
[0005]为了解决本领域目前面对的技术问题，本发明提供一种具有免疫活性的长春花外泌体纳米囊泡；
[0006]具体地，长春花外泌体纳米囊泡包括长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡、长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡；
[0007]具体地，本发明提供一种包含长春花叶片来源外泌体纳米囊泡以及药学上可接受载体的药物组合物。
[0008]具体地，所述长春花外泌体纳米囊泡在制备用于抗肿瘤活物的用途[0009]优选地，所述长春花外泌体纳米囊泡在制备用于直肠癌药物的用途[0010]优选地，所述长春花外泌体纳米囊泡具有载药功能，可以进行跨物种的通讯和调控。
[0011]具体地，所述长春花外泌体纳米囊泡在制备无需肠溶包衣的普通口服药物制剂的用途，能够耐受强酸、强碱、以及耐受RNA酶、DNA酶以及蛋白酶的消化而不失去活性[0012]优选地，所述药物组合物包括长春花叶片来源外泌体纳米囊泡和长春花茎形成层
干细胞来源外泌体样纳米囊泡
[0013]优选地，所述长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡制备方法如下：
[0014]1)长春花叶片的酶解：采摘新鲜的长春花叶片，冲洗擦干。配制含有纤维素酶(每100毫升3克)和果胶酶(每100毫升0.2克)，pH在5.75～5.80之间的酶解液。每2g叶片加入100ml酶解溶液，并在25℃下，在摇床上以100rpm的速度在黑暗中孵育至少12h。静置，留取上层液体，以1000rpm离心20min除去杂质。然后在4℃条件下10000rpm离心40min，重复离心3次，取上清液，用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。
[0015]2)一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心
管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得CLEN。[0016]3)CLEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对CLEN进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在‑80℃环境中储存直至使用。
[0017]优选地，所述长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡制备方法如下：[0018]1)细胞预培养及上样前准备：取生长良好的长春花茎形成层干细胞，每100ml液体培养基加入2g细胞，于完全黑暗条件中，120rpm悬浮培养7天。液体培养基含有20g/L蔗糖、2.0mg/Lα‑萘乙酸(NAA)和4.43g/L MS培养基，pH在5.75～5.80之间。悬浮培养7天后，用纱布过滤植物细胞并收集培养基。10000×g，4℃，10min，离心3次除去杂质，收集上清液。滤液用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。
[0019]2)一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得CMCEN。[0020]3)CMCEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对CLEN进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在‑80℃环境中储存直至使用。
[0021]具体地，所述药物组合物在制备用于肠溶包衣药物制剂的用途，可以耐受强碱环境。
[0022]优选地，所述药物组合物包括长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡和长春花茎来源外泌体样纳米囊泡
[0023]优选地，所述长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡制备方法如下：[0024]1)细胞预培养及上样前准备：取生长良好的长春花叶愈伤组织，每100ml液体培养基加入4g细胞，于完全黑暗条件中，120rpm悬浮培养7天。液体培养基含有20g/L蔗糖、2.0mg/Lα‑萘乙酸(NAA)和4.43g/L MS培养基，pH在5.75～5.80之间。悬浮培养7天后，用纱布过滤植物细胞并收集培养基。10000×g，4℃，10min，离心3次除去杂质，收集上清液。滤液用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。
[0025]2)一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得DDCEN。[0026]3)DDCEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对
DDCEN进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在‑80℃环境中储存直至使用。
[0027]优选地，所述长春花茎来源外泌体样纳米囊泡制备方法如下：
[0028]采摘新鲜的长春花，剪去叶片，保留地上茎组织。将长春花茎裁剪成3cm的小段，每100g长春花茎放入200ml 4℃预冷的PBS，在匀浆机中破碎。使用三层纱布过滤植物组织，留取滤液。在4℃条件下10000rpm离心10min，重复离心3次，取上清液，用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。
[0029]一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得长春花茎来源外泌体样纳米囊泡(Catharanthus roseus stem‑derived exosome‑like nanovesicles, CSEN)。
[0030]CSEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对CSEN进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在‑80℃环境中储存直至使用。
[0031]本发明相对于已有技术，其创新性在于：
[0032](1)本发明公开了一种能够调节单核巨噬细胞免疫活性的长春花来源外泌体样纳米囊泡，所述纳米囊泡包括长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡、长春花叶愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎来源外泌体样纳米囊泡，具有极为重要的临床意义。
[0033](2)本发明公开了一种能够耐受蛋白酶、核酸酶消化并且经强酸强碱处理后依然能够稳定发挥活性的纳米囊泡，具有极强的临床应用价值。
[0034](3)本发明公开了一种能够诱导单核巨噬细胞向M1型极化并分泌促炎相关细胞因子的纳米囊泡，M1巨噬细胞通过激活烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸氧化酶系统并随后产生活性氧参与感染期间的病原体清除。因此，M1巨噬细胞具有很强的抗微生物和抗肿瘤活性；M2巨噬细胞通过IL‑4受体α激活STAT6，被Tp细胞因子IL‑4和IL‑13极化，具有抗炎作用。本发明公开的长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡能够刺激巨噬细胞向M1型极化，并分泌肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)，具有调控肿瘤免疫微环境的活性。
[0035](4)本发明的一个实施例公开了CLEN可以被鼠单核巨噬细胞RAW264.6细胞摄取，并且随着CLEN给药时间的延长，RAW细胞中红荧光增强，提示CLEN在RAW细胞中逐渐积累。本发明公开的CLEN有载药潜能，可以进行跨物种的通讯和调控。
[0036](5)本发明的一个实施例公开了CLEN以及CMCEN可以被人源结直肠癌细胞DLD‑1摄取，并在胞浆中积累，作为制备结直肠癌药物的用途
[0037](6)本发明公开了一种新型植物来源外泌体样纳米囊泡的提取分离方法。
附图说明
[0038]图1：长春花来源外泌体样纳米囊泡的物理特征鉴定
[0039](a‑c)长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡(Catharanthus roseus leaves‑derived exosome‑like nanovesicles,CLEN)(a)、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳
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