(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510959290.7
(22)申请日 2015.12.18
C12P 7/16(2006.01)
C12R 1/145(2006.01)
(71)申请人清华大学
地址100084 北京市海淀区100084-82信箱
(72)发明人张建安 王根宇 顾春凯 刘宏娟
程可可 周玉杰
(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事
务所(普通合伙) 11201
代理人李志东
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提出利用木质纤维素生产丁醇的方
母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及
(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二
发酵处理，以便得到丁醇。本发明利用木质纤维素
生产丁醇的方法能够有效地脱除木质纤维素经过
酸水解处理得到的水解液中的糠醛和5-羟甲基
糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能
够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现
木质纤维素的回收利用。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页CN 105420291 A 2016.03.23
C N 105420291
A
1.一种利用木质纤维素生产丁醇的方法，其特征在于，包括：
(1)将所述木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液；
(2)利用所述水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及
(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇，
优选地，所述酵母菌为粘红酵母。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产丁醇梭菌选自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，优选丙酮丁醇梭菌，
任选地，所述木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸水解处理包括：
将所述木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及
将所述混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，任选地，
所述酸溶液包括0.5质量体积％的H
2SO
4
和1.5质量体积％的H
3
PO
4
。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
将所述混合物在135摄氏度的温度下进行酸水解处理1小时，得到水解液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌的接种量为5～10体积％，所述第一发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时，优选地，所述酵母菌的接种量为5体积％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止所述第一发酵处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将所述第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到所述脱毒水解液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于所述脱毒水解液中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产丁醇梭菌预先经过活化处理，所述活化处理包括：
(1)将保存于-80摄氏度的所述产丁醇梭菌接种于玉米培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到一级种子液；以及
(2)将所述一级种子液按照5～10体积％的接种量接种于P2培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到二级种子液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述玉米培养基包括玉米醪及水；
所述P2培养基包括40g/L的葡萄糖、1g/L的酵母粉、1质量％缓冲液、1重量％营养液及水，
所述缓冲液包括磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L，
所述营养液包括1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠。
利用木质纤维素生产丁醇的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物化工领域。具体地，本发明涉及利用木质纤维素生产丁醇的方法。
背景技术
[0002] 丁醇是良好的石油替代燃料和重要的化工原料，广泛应用于食品、医药、塑料、印染等方面。与乙醇相比，丁醇具有能量密度高，腐蚀性低，可以任意比例与汽油互溶，对现有的发动机和输油管道无需改造而直接利用等优点，因而更具应用潜力。
[0003] 木质纤维素作为自然界中来源最为广泛，价格极为低廉，且能再生的绿资源，木质纤维素经过预处理后，能够降解为含有多种能够被利用的糖类的水解液，再利用生物转化方法，如微发酵过程，将产生的糖类转化成生物燃料，作为生产丁醇的原料。
[0004] 然而，目前利用木质纤维素生产丁醇的方法仍有待改进。
发明内容
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供利用木质纤维素生产丁醇的方法。该方法能够有效地脱除木质纤维素经过酸水解处理得到的水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现木质纤维素的回收利用。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 产丁醇梭菌本身缺乏分解纤维素的酶类，不能直接利用木质纤维素。由于纤维素酶的骨架蛋白架蛋白相对复杂，需要多种酶的协同作用才能完成降解纤维素，所以通过基因工程手段引入异源纤维素酶的基因，容易使异源酶在产丁醇梭菌中的表达“失速”，还会影响细胞本身总体的蛋白分泌，进而导致细胞死亡。添加纤维素酶，能够对木质纤维素进行酶解处理，但是其成本较高。相比于条件温和的酶解处理，酸或碱水解处理效率较高，尤其是酸处理。然而，酸处理过程中形成的单糖会进一步降解，产生抑制物，如糠醛、5-羟甲基糠醛和乙酸等，这些抑制物直接或间接抑制产丁醇梭菌生长及发酵。因此，需要对酸水解处理得到的水解液进行脱毒处理。然而，采用物理法(真空蒸发等)或化学法(活性炭吸附、离子交换树脂吸附、沉淀等)对设备和工艺要求较高，成本也相应增加，甚至超过直接利用淀粉类物质的成本，从而限制了木质纤维素作为丁醇发酵的原料。
[0008] 本发明的发明人经过大量实验发现，将木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液，利用酵母菌能够代谢水解液中抑制物的特性，将酵母菌接种于水解液中进行发酵处理，有效地脱除水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，得到脱毒水解液，然后将产丁醇梭菌接种于脱毒水解液中进行发酵处理，产生丁醇。
[0009] 本发明提出了一种利用木质纤维素生产丁醇的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将
所述木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液；(2)利用所述水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇。根据本发明的优选实施例，所述酵母菌为粘红酵母。由
此，根据本发明实施例的方法能够有效地脱除水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现木质纤维素的回收利用。
[0010] 根据本发明的实施例，上述利用木质纤维素生产丁醇的方法还可以具有下列附加技术特征：
[0011] 根据本发明的实施例，所述产丁醇梭菌选自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，优选丙酮丁醇梭菌。
[0012] 根据本发明的实施例，所述木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
[0013] 根据本发明的实施例，所述酸水解处理包括：将所述木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及将所述混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，根据本发明的具体示例，所述酸溶液包
括0.5质量体积％H
2SO
4
和1.5质量体积％H
3
PO
4
。由此，能够有效地将木质纤维素降解为
糖类，同时使较少的糖类进一步降解为抑制物。
[0014] 根据本发明的实施例，将所述混合物在135摄氏度的温度下进行酸水解处理1小时，得到水解液。由此，能够有效地将木质纤维素降解为糖类，同时使较少的糖类进一步降解为抑制物。
[0015] 根据本发明的实施例，所述酵母菌的接种量为5～10体积％，所述发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时，根据本发明的优选实施例，所述酵母菌的接种量为5体积％。由此，能够使酵母菌充分脱除水解液中的抑制物。
[0016] 根据本发明的实施例，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止所述第一发酵处理。由此，能够使酵母菌充分脱除水解液中的抑制物。
[0017] 根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将所述第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到所述脱毒水解液。由此，能够有效地除去酵母菌。
[0018] 根据本发明的实施例，将产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于所述脱毒水解液中。由此，能够使产丁醇梭菌充分脱毒水解液生产丁醇。
[0019] 根据本发明的实施例，所述产丁醇梭菌预先经过活化处理，所述活化处理包括：(1)将保存于-80摄氏度的所述产丁醇梭菌接种于玉米培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到一级种子液；以及(2)将所述一级种子液按照5～10体积％的接种量接种于P2培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到二级种子液。由此，能够使产丁醇梭菌充分利用脱毒水解液生产丁醇。
[0020] 根据本发明的实施例，所述玉米培养基包括玉米醪及水；所述P2培养基包括40g/ L的葡萄糖、1g/L的酵母粉、1质量％缓冲液、1重量％营养液及水，所述缓冲液包括磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L，所述营养液包括1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠。由此，能够使产丁醇梭菌充分利用木质纤维素水解液生产丁醇。
[0021] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
[0022] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0023] 本发明提出利用木质纤维素生产丁醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
[0024] (1)将木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液。
[0025] 在该步骤中，通过酸水解处理降解木质纤维素，形成多种单糖，以使单糖被产丁醇梭菌利用。根据本发明的实施例，酸水解处理包括：将木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及将混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，根据本发明的具体示例，酸溶液包括0.5质量体积％
H 2SO
4
和1.5质量体积％H
3
PO
4
。根据本发明的优选实施例，将混合物在135摄氏度的温度下
进行酸水解处理1小时，得到水解液。发明人经过大量实验优化得到最优酸处理条件，在此条件下能够有效地产生大量单糖，并使单糖较少地降解成抑制物。酸水解温度过高或者时间过长，会产生大量抑制物，且得到的糖含量较低；温度过低或者时间过短，降解得到的糖含量较低。
[0026] 需要说明的是，本发明对木质纤维素的种类不作严格限定，只要能够将其水解，得到糖类，以供微生物利用即可。根据本发明的具体实施例，木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
[0027] (2)利用水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液。
[0028] 在该步骤中，根据本发明的优选实施例，酵母菌为粘红酵母。发明人意外地发现，将粘红酵母接
种于水解液中，开始时，粘红酵母主要代谢抑制物，当抑制物殆尽时再迅速代谢糖类。利用该特性能够除去水解液中的抑制物，同时糖损失较少，有效地起到脱毒的效果。根据本发明的实施例，酵母菌的接种量为5～10体积％，第一发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时。根据本发明的优选实施例，酵母菌的接种量为5体积％。发明人经过大量实验优化得到最优接种量及发酵条件。接种量过少，代谢抑制物的时间过长，接种量过多，酵母生长迅速，可能造成糖类的大量损失。发酵时间过短，不能充分代谢抑制物，导致水解液中抑制物含量较高，进而无法使产丁醇梭菌正常代谢产丁醇，甚至无法生长。发酵时间过长，酵母菌会进一步代谢糖类，造成糖损失。根据本发明的实施例，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止第一发酵处理。发明人经过大量实验发现，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，产丁醇梭菌能够利用该发酵液进行发酵生产。
[0029] 根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到脱毒水解液。将发酵产物进行离心或者加热处理，能够有效地除去或杀死酵母菌。若产丁醇梭菌直接利用含有酵母菌的发酵处理产物，产丁醇梭菌会与酵母菌竞争性地生长代谢，进而影响产丁醇梭菌的代谢能力。[0030] (3)利用脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇。
[0031] 根据本发明的实施例，将产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于脱毒水解液中。发明人经过大量实验优化得到最优接种量，由此，能够有效地利用脱毒水解液进行发酵产丁醇。
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