(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811160298.7
(22)申请日 2018.09.30
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2018456 2018.07.06
(71)申请人 上海凯赛生物技术股份有限公司
地址 201203 上海市浦东新区上海市自由
贸易试验区蔡伦路1690号5幢4楼
申请人 CIBT美国公司
(72)发明人 雷云凤 刘修才
(74)专利代理机构 北京律智知识产权代理有限
公司 11438
代理人 董天宝 于宝庆
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/54(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)C12P 13/08(2006.01)C12P 13/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本申请提供一种新的L -赖氨酸耐受菌、由其
产生的L -赖氨酸生产菌及其生产L -赖氨酸和1,
5-
戊二胺的方法。权利要求书1页 说明书6页序列表8页 附图1页CN 110964682 A 2020.04.07 C N 110964682
A
1.L -赖氨酸耐受菌，其是保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号为CCTCC NO：M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株M11-A3。
2.L -赖氨酸生产菌，其通过在权利要求1的L -赖氨酸耐受菌中过表达tRNA甲基转移酶而获得。
3.如权利要求1的L -赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、沙雷菌(Shewanella oneidensis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、弗氏单胞菌(Aeromonas fluvialis)、杆菌(Bacillus anthracis)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
4.如权利要求2或3的L -赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因。 5.如权利要求4的L -赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶基因是SEQ ID No:1的yjtD基因，SEQ ID No:3的yfhQ基因、SEQ ID No:4的yibK基因或者SEQ ID No:5的spoU基因。
6.如权利要求4的L -赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶基因是来自大肠杆菌的SEQ ID No:1的yjtD基因，来自大肠杆菌的SEQ ID No:3的yfhQ基因、来自大肠杆菌的SEQ ID No:4的yibK基因或者来自大肠杆菌的SEQ ID No:5的spoU基因，或者与前述任一者具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
7.生产L -赖氨酸的方法，所述方法包括使用权利要求2-5任一项所述的L -赖氨酸生产菌。
8.生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括使用权利要求2-5任一项所述的L -赖氨酸生产菌。
9.tRNA甲基转移酶基因在微生物发酵生产中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述tRNA甲基转移酶基因经密码子优化后，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染体上。
权 利 要 求 书1/1页CN 110964682 A
L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途
技术领域
[0001]本申请涉及一种L-赖氨酸高耐受菌、由其产生的L-赖氨酸生产菌及其用途，例如生产L-赖氨酸或1,5-戊二胺。
背景技术
[0002]通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化的生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。
[0003]在各种已知的生物体中，成熟的rRNA和tRNA分子，在核糖核酸的不同位置包含有多种修饰，这些修饰能够拓展它们的化学和功能多样性并且加强它们的结构稳定性。在RNA 复合体成熟过程中，修饰酶能够专一识别RNA分子并在特定的位置进行甲基化修饰。在模式生物大肠杆菌和酿酒酵母中，已鉴定到多种甲基转移酶参与这一过程。从蛋白序列同源比对的结果来看，甲基转移酶编码基因yjtD、yfhQ、yibK和spoU的蛋白相似性较高，yggH、yaeB 和yecP基因的蛋白序列相似性较高，rumT、yfiC、trmD和yfgB基因的蛋白序列相似性较高(序列比对结果见图1)。
[0004]据报道，通过对链球菌属肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲基转移酶编码基因t r m D的下调表达，发现该基因是菌株生长所必需的(O'D w y e r K e t,a l.J Bacteriol.2004Apr；186(8):2346-54.)。大肠杆菌中甲基转移酶编码基因trmD的敲除导致菌株生长速率有几倍的降低(Persson BC,et,al.J Bacteriol.1995Oct；177(19):5554-60.)。
[0005]目前，没有报道通过过表达甲基转移酶基因获得L-赖氨酸生产菌。赖氨酸脱羧酶可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO2。而1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。
发明内容
[0006]一方面，提供了L-赖氨酸耐受菌，其于2018年07月06日保藏在位于武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，是保藏编号为CCTCC NO：M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株M11-A3。
[0007]另一方面，提供了L-赖氨酸生产菌，其通过在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株M11-A3(保藏号为CCTCC NO:M 2018456)中过表达tRNA甲基转移酶基因而获得。
[0008]在本文中，术语“过表达”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。
[0009]在一些实施方案中，tRNA甲基转移酶基因可以来源于微生物、动物或植物，如来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、沙雷菌(Shewanella oneidensis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、弗氏单胞菌(Aeromonas fluvialis)、杆菌(Bacillus anthracis)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
[0010]在一些实施方案中，所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因，例如SEQ ID No:1的yjtD基因，SEQ ID No:3的yfhQ基因、SEQ ID No:4的yibK基因或者SEQ ID No:5的spoU基因。
[0011]在一些实施方案中，所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因，例如来自大肠杆菌的SEQ ID No:1的yjtD基因，来自大肠杆菌的SEQ ID No:3的yfhQ基因、来自大肠杆菌的SEQ ID No:4的yibK基因或者来自大肠杆菌的SEQ ID No:5的spoU基因，或者与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
[0012]再一方面，提供了生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括使用上述L-赖氨酸生产菌。[0013]再一方面，提供了生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括使用上述L-赖氨酸生产菌。
附图说明
[0014]图1显示了大肠杆菌MG1655中tRNA甲基转移酶的蛋白序列相似性比对结果。
实施例
[0015]应当理解，尽管这些技术示例了实施本发明的优选实施方案，根据本公开，本领域技术人员会认识到，可以进行众多修改而不脱离本发明的精神和预期范围。还应当理解，本文所用的术语用于仅描述具体实施方案并且不意在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等同物限定。
[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0018]实施例1：诱变获得酸耐受株
[0019]从大肠杆菌li MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过ARTP物理诱变后L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。
[0020]具体地，接种MG1655菌株至50mL的LB培养基，待菌体浓度到OD600＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至ARTP仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释102和103倍后，全部涂板M9培养基，其中该培养基中添加4mg/L的L-赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)。在未添加AEC的平板上分别涂布未诱变的MG1655菌(稀释105倍的菌液)，
以及诱变处理后的菌体(稀释103倍的菌液)。37℃培养两天后，获得AEC耐受能力提高的菌株共36株。挑取单菌落至30ul无菌生理盐水，获得浑浊的菌液。取3uL划线至不断增加浓度的AEC平板进行复筛，最后确认M11菌株耐受能力最强。
[0021]从新突变株M11出发，如上所述，通过ARTP物理诱变和高浓度AEC添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株M11，分别接种于不含抗生
素的5ml种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物，,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸，购自英格兰OXOID LTD.)进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72小时，利用核磁检测计算各培养基中的赖氨酸的含量(表1)。
[0022]表1.核磁检测24株新突变株与出发菌株M11相比的赖氨酸产量及OD600
[0023]
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