(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911391198.X
(22)申请日 2019.12.30
(71)申请人 深圳市人民医院
地址 518003 广东省深圳市罗湖区东门北
路1017号
(72)发明人 张其清 江一波 林璐琳 葛树娜
(74)专利代理机构 厦门原创专利事务所(普通
合伙) 35101
代理人 郭金华
(51)Int.Cl.
C12Q 1/686(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种提高PCR扩增效率方法，
在反应体系中加入AMP缓冲液，
扩增效率高。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图1页CN 111139290 A 2020.05.12
C N 111139290
A
1.一种提高PCR扩增效率方法，其特征在于：在反应体系中加入AMP缓冲液。
2.根据权利要求1所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述加入的AMP缓冲液的体积占整个反应体系的0.5％～1.5％。
3.根据权利要求1所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述PCR过程采用两步扩增，第一步扩增采用上游引物和下游引物，第二步扩增采用锚定引物和上游引物，或者锚定引物下游引物。
4.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述第二步扩增的退火温度比所述第二步扩增的退火温度低0.5～2℃。
5.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述PCR过程中使用的DNA聚合酶为Taq酶。
6.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述第二次扩增的循环变性的时间比第一扩增的循环变性时间短5％～15％。
7.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述第一次扩增的片段长度不超过2000bp，所述第二次扩增的片段长度不超过1500bp。
8.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述第一次扩增和第二次扩增的循环数均为16～18。
9.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述PCR的引物通过引物设计在线网站Primer 3设计。
10.根据权利要求3所述的提高PCR扩增效率方法，其特征在于：所述提高PCR扩增效率方法的反应体系为20μl PCR扩增体系，DNA聚合酶0.5μl，dNTP为1μl ，镁离子为1μl ，引物各为1μl，扩增Buffer为2μl，基因组DNA稀释后浓度为5pg/μl，20μl体系中超纯水加入最大量为13.5μl。
权 利 要 求 书1/1页CN 111139290 A
一种提高PCR扩增效率方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种提高PCR扩增效率方法，属于生物技术领域。
背景技术
[0002]目前，PCR技术已经发展成为现代分子生物学的重要的检测技术，在分子检测和诊断的过程中，起到极为重要的作用。PCR技术能够对微量信号分子进行放大，有利于下游信号通路的检测。利用PCR进行检测，能够对信号放大数百万倍，实现对微量目标基因的检测。[0003]在某种程度上，在微量样品的PCR鉴定的过程中，由于模板来源异常复杂，会面临到扩增产物不理想，特异性较差的系列因素，导致在PCR扩增的效率不高，PCR检测的灵敏度低。
发明内容
[0004]本发明提供了一种提高PCR扩增效率方法，可以有效解决上述问题。
[0005]本发明是这样实现的：
[0006]一种提高PCR扩增效率方法，在反应体系中加入AMP缓冲液。
[0007]作为进一步改进的，所述加入的AMP缓冲液的体积占整个反应体系的0.5％～1.5％。
[0008]作为进一步改进的，所述PCR过程采用两步扩增，第一步扩增采用上游引物和下游引物，第二步扩增采用锚定引物和上游引物，或者锚定引物下游引物。
[0009]作为进一步改进的，所述第二步扩增的退火温度比所述第二步扩增的退火温度低0.5～2℃。
[0010]作为进一步改进的，所述PCR过程中使用的DNA聚合酶为Taq酶。
[0011]作为进一步改进的，所述第二次扩增的循环变性的时间比第一扩增的循环变性时间短5％～15％。
[0012]作为进一步改进的，所述第一次扩增的片段长度不超过2000bp，所述第二次扩增的片段长度不超过1500bp。
[0013]作为进一步改进的，所述第一次扩增和第二次扩增的循环数均为16～18。[0014]作为进一步改进的，所述PCR的引物通过引物设计在线网站Primer 3设计。[0015]作为进一步改进的，所述提高PCR扩增效率方法的反应体系为20μlPCR扩增体系，DNA聚合酶0.5μl，dNTP为1μl，镁离子为1μl，引物各为1μl，扩增Buffer为2μl，基因组DNA稀释后浓度为5pg/μl，20μl体系中超纯水加入最大量为13.5μl。
[0016]本发明的有益效果是：
[0017]本发明提供一种新型的提高PCR扩增效率方法，能够解决现有的PCR扩增效率低下的问题，即使在比较粗的DNA样品，微量DNA样品，甚至存在PCR抑制的相关条件下，也能取得较好的扩增效果。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。 [0019]图1是本发明实施例提供的DNA扩增检测图。
具体实施方式
[0020]为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0021]实施例1
[0022]测试目的靶序列为NCBI登陆号NG_007992.1，为actin内参基因。第一次扩增的外向引物为5’ACC
GCCGAGACCGCGTCCGC，如SEQ ID 01所示，和3’GTTGTCGACGACGAGCGCGGC，如SEQ ID 02所示。扩增条件为起始95度变性2min，第一次循环阶段为95度变性35秒，56度退火30秒，72度延伸30秒，扩增18个循环，最后72度延伸5分钟，16度下恢复。第二次扩增的引物为5’GTGCAGAGCCGCCGTCTGG(内向左)，如SEQ ID 03所示，和5’GCAGGAAGTGCGCGCAAGCGCC (内向右)，如SEQ ID 04所示。第二次循环阶段为95度变性30秒，55度退火30秒，72度延伸30秒，扩增18个循环，最后72度延伸5分钟，16度下恢复。
[0023]采用普通常用的20μl PCR扩增体系，聚合酶采用全式金的普通快速DNA聚合酶0.5μl，dNTP为1μl，镁离子为1μl，引物各为1μl，扩增Buffer为2μl，基因组DNA稀释后浓度为5pg/μl，20μl体系中超纯水加入最大量为13.5μl。
[0024]引物的设计采用引物设计在线网站Primer 3：/primer3-0.4.0/，浏览查询，并且通过特定测试Blast引物工具在线测试引物的特异性，并且利用NCBI Pickprimer程序检索，确保引物特异唯一。
[0025]假设以微量样品DNA的处理为例。在反应的过程中，对照组加入1mM/L的三氯化铁，三氯化铁能够干扰PCR反应的进行。在实验组中，依次加入0.5％，1.0％，1.5％的AMP缓冲液。AMP缓冲液能够格外增强DNA的溶液分配效率，提高DNA聚合酶的聚合作用。所有的结果都在1.5％含有EB 0.1％的琼脂糖凝胶上电泳染进行检测，结果如图1所示。
[0026]如图1所示，原始的提高PCR扩增效率方法，所得到的PCR产物量微弱，染条带很浅，而且三氯化铁可以显著干扰PCR反应，导致没有条带产生。原始PCR的基础之上酶量加大一倍、镁离子含量加大一倍及模板含量加大一倍也会使条带更加明显。本发明的提高PCR扩增效率方法，在反应体系中加入AMP缓冲液，随着AMP缓冲液的浓度的加大，条带越明显，说明在反应液中加入AMP缓冲液能够更有效的扩增含有微量基因组DNA。这个结果，即使是在
加入了三氯化铁，干扰抑制了PCR反应的情况下，扩增效果依然能够得到一定的显著改善。[0027]以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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