(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011561297.0
(22)申请日 2020.12.25
(71)申请人 北京泽辉辰星生物科技有限公司
地址 102200 北京市昌平区科技园区双营
西路86号院3号楼1至4层1单元101
(72)发明人 张愚 甘一迪 罗艳超 叶阳苗
徐然然 王淑艳
(74)专利代理机构 中国贸促会专利商标事务所
有限公司 11038
代理人 张小勇
(51)Int.Cl.
G01N 21/31(2006.01)
G01N 21/78(2006.01)
G01N 33/15(2006.01)
(54)发明名称
活性检测方法
(57)摘要
本发明涉及满足产品放行要求的免疫调节
干细胞吲哚胺2,3‑双加氧酶1(IDO1)活性检测方
法。本发明提供了一种规范的、
易于标准化的、能够用于表征和放行间充质干细胞类细胞产 品的免疫调控功能的检验方法，从而将临床免疫
调节效应评价前置，提高临床试验的成功率，降
低受试者风险，指导间充质干细胞成药。本发明
制备了同质参考品细胞即工作参考品细胞，建立
相对生物学活性检验方法，有利于剔除系统误差
引起的检测结果超标或结果不可信。权利要求书1页 说明书10页 附图3页CN 112748080 A 2021.05.04
C N 112748080
A
1.一种检测供试品是否满足产品放行要求的方法，所述方法包括：
用含有干扰素γ即IFN ‑γ和不含IFN ‑γ的培养基分别培养待检测的供试品以刺激供试品；
收集培养上清，并使所收集的上清发生显反应；以及
测量显结果以获得吲哚胺2,3‑双加氧酶1即IDO1活性，从而获得供试品产生的L ‑犬尿氨酸的量，
其中所述方法还包括检测同质参考品细胞的IDO1活性以获得同质参考品细胞产生的L ‑犬尿氨酸的量，
其中如果供试品相对于同质参考品细胞的相对生物学活性≥60％，则判定所述供试品符合产品放行要求。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供试品包含间充质干细胞，任选地所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、人胚干细胞分化的间充质样干细胞、人诱导多能干细胞分化的间充质样干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述同质参考品细胞由人胚干细胞定向分化得到，任选地，所述同质参考品细胞分化后经历5‑15次传代。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中依下式计算供试品相对生物学活性：供试品相对生物学活性＝(IFN ‑γ刺激的供试品产生的L ‑犬尿氨酸的量‑未刺激的供试品产生的L ‑犬尿氨酸的量)/(IFN ‑γ刺激的同质参考品细胞产生的L ‑犬尿氨酸的量‑未刺激的同质参考品细胞产生的L ‑犬尿氨酸的量)×100％。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中根据L ‑犬尿氨酸的标准曲线计算产生的L ‑犬尿氨酸的量，并且其中L ‑犬尿氨酸标准品的浓度为从500μmol/L开始按照倍比稀释的方式连续稀释的梯度。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中细胞接种密度为2.5×104个/孔至2.5×105个/孔，优选1×105个/孔，IFN ‑γ浓度为10‑1000ng/ml，优选200ng/ml，刺激时间为24‑48h，优选48h；
任选地，其中取上清与PDAB反应，优选与现用现配的PDAB反应；
任选地，其中上清无需稀释；
任选地，其中对不同厂家的IFN ‑γ进行筛选，以筛选出合适厂家的IFN ‑γ用于刺激供试品。
7.一种同质参考品细胞，其由人胚干细胞定向分化得到，任选地，其分化后经历5‑15次传代得到。
8.一种试剂盒，其包括根据权利要求7所述的同质参考品细胞以及用于执行根据权利要求1‑6中任一项所述的方法的说明书。
9.根据权利要求7所述的同质参考品细胞在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测供试品是否满足产品放行要求。
10.根据权利要求7所述的同质参考品细胞在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于具有类似于间充质干细胞免疫调控特性的干细胞的体外效力检测、成药性评价、产品放行和表征。
权 利 要 求 书1/1页CN 112748080 A
满足产品放行要求的免疫调节干细胞IDO1活性检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物领域，并具体涉及间充质干细胞的生物学活性评价方法。
背景技术
[0002]近年来，间充质干细胞药品研究进展迅猛，但由于间充质干细胞的来源、制备批次、使用细胞代次、体外处理方式等的不同，产品有效性异质化程度高，缺少有效的生物学活性评价的金标准。
[0003]国际细胞协会建议免疫功能检测作为间充质干细胞临床试验的放行标准。中国食品药品检定研究院生物制品检定所的纳涛等人公开了一种基于吲哚胺2,3‑双加氧酶1 (IDO1)活性评价人间充质干细胞免疫调控功能的吸光光度法，但是该方法未考虑实验系统本身差异的影响，且未确定质量标准。
发明内容
[0004]本发明的目的在于建立一种规范的、易于标准化的、能够用于表征和放行间充质干细胞类细胞产品的免疫调控功能的检验方法，从而将临床免疫调节效应评价前置，提高临床试验的成功率，降低受试者风险，指导间充质干细胞成药及临床应用。
[0005]本发明首次提出并制备了同质参考品细胞即工作参考品细胞，建立了相对生物学活性检验方法，有利于剔除系统误差引起的检测结果超标或结果不可信。
[0006]本发明的同质参考品细胞是指由人胚干细胞定向分化得到的间充质样干细胞，任选地，所述同质参考品细胞由人胚干细胞定向分化得到的第5‑15代间充质样干细胞。本领域技术人员知晓的是，同质参考品是指定量检测某些制品的生物效价的参考物质，其生产原材料应与供试品同质，不应含有干扰性杂质，应有足够的稳定性和高度的特异性，并有足够的数量。
[0007]本发明提供了检测方法的相关参数和数据分析。
[0008]本发明建立了一种相对生物学活性检验方法，能够用于评价不同来源、不同批次、不同代次和生产工艺下制备的间充质干细胞的免疫调控能力，解决了因方法本身引起的系统误差，降低了检测结果的变异度，提升了精密度和准确性。
[0009]本发明的方法能够用于具有类似于间充质干细胞免疫调控特性的干细胞体外效力检测、成药性评价、产品放行和表征等。
[0010]本发明使用了工作参考品细胞，消除了系统误差对检测结果的影响。该参考品细胞来源稳定、批产量大，满足参考品工作要求。
[0011]本发明提出的同质参考品(工作参考品)概念，为细胞行业首次。这极大促进了行业标准的推进，引领行业健康发展。
[0012]因此，在一方面，本发明提供一种检测供试品是否满足产品放行要求的方法，所述方法包括：
[0013]用含有干扰素γ即IFN‑γ和不含IFN‑γ的培养基分别培养待检测的供试品以刺
激供试品；
[0014]收集培养上清，并使所收集的上清发生显反应；以及
[0015]测量显结果以获得吲哚胺2,3‑双加氧酶1即IDO1活性，从而获得供试品产生的L‑犬尿氨酸的量，
[0016]其中所述方法还包括检测同质参考品细胞的IDO1活性以获得同质参考品细胞产生的L‑犬尿氨酸的量，
[0017]其中如果供试品相对于同质参考品细胞的相对生物学活性≥60％，则判定所述供试品符合产品放行要求。
[0018]在一个实施方案中，所述供试品包含间充质干细胞，任选地所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、人胚干细胞分化的间充质样干细胞、人诱导多能干细胞分化的间充质样干细胞中的一种或多种。[0019]在另一个实施方案中，所述同质参考品细胞由人胚干细胞定向分化得到，任选地，所述同质参考品细胞分化后经历5‑15次传代。
[0020]在又一个实施方案中，依下式计算供试品相对生物学活性：
[0021]供试品相对生物学活性＝(IFN‑γ刺激的供试品产生的L‑犬尿氨酸的量‑未刺激的供试品产生的L‑犬尿氨酸的量)/(IFN‑γ刺激的同质参考品细胞产生的L‑犬尿氨酸的量‑未刺激的同质参考品细胞产生的L‑犬尿氨酸的量)×100％。
[0022]在另一个实施方案中，根据L‑犬尿氨酸的标准曲线计算产生的L‑犬尿氨酸的量，并且其中L‑犬尿氨酸标准品的浓度为从500μmol/L开始按照倍比稀释的方式连续稀释的梯度。
[0023]在又一个实施方案中，细胞接种密度为2.5×104个/孔至2.5×105个/孔，优选1×105个/孔，IFN‑γ浓度为10‑1000ng/ml，优选200ng/ml，刺激时间为24‑48h，优选48h。[0024]在另一个实施方案中，取上清与PDAB反应，优选与现用现配的PDAB反应。[0025]在又一个实施方案中，上清无需稀释。
[0026]在另一个实施方案中，对不同厂家的IFN‑γ进行筛选，以筛选出合适厂家的IFN‑γ用于刺激供试品。
[0027]在另一方面，本发明提供一种同质参考品细胞，其由人胚干细胞定向分化得到，任选地，其分化后经历5‑15次传代得到。
[0028]在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括本发明的同质参考品细胞以及用于执行本发明的方法的试剂以及相应的说明书。
[0029]在又一方面，本发明提供本发明的同质参考品细胞在制备试剂盒中的用途。[0030]在一个实施方案中，所述试剂盒用于检测供试品是否满足产品放行要求。[0031]在另一个实施方案中，所述试剂盒用于具有类似于间充质干细胞免疫调控特性的干细胞的体外效力检测、成药性评价、产品放行和表征。
[0032]本发明首次提出将IDO1活性检测作为间充质干细胞免疫调控能力放行检验的金方法和金标准。本发明的方法和标准可推广至不同来源的间充质干细胞研究单位(企业、科研院所和医疗机构等)，带动行业健康发展。
[0033]本发明为间充质干细胞免疫调控评价提供金标准，指导标准化试剂盒的开发，带来巨大社会经济效益。
[0034]附图简要说明
[0035]图1是L‑犬尿氨酸标准品标准曲线示意图。
[0036]图2是L‑犬尿氨酸标准品曲线以及拟合结果。
[0037]图3是检测前和检测前6h制备2％PDAB标准曲线以及标准曲线拟合结果。[0038]图4是细胞按两种接种浓度接种后经不同浓度的干扰素γ(IFN‑γ)刺激后，细胞培养上清中的L‑犬尿氨酸表达量结果的柱形图。
[0039]图5是细胞按两种接种浓度接种后经IFN‑γ不同刺激时机后检测结果的柱形图。[0040]图6是不同厂家的IFN‑γ刺激后的结果的柱形图。
具体实施方式
[0041]本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。
[0042]如无相反指示，本发明所用试剂均为市售可得试剂。本发明所用仪器、设备、装置等，均为常规实验室所用仪器、设备、装置等。
[0043]实施例
[0044]实施例1‑干细胞分泌IDO1相对活性检测
[0045]不同来源的间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、人胚干细胞分化的间充质样干细胞、人诱导多能干细胞分化的间充质样干细胞等)在炎症因子IFN‑γ刺激下，能够分泌吲哚胺2,3‑双加氧酶1(IDO1)。IDO1能够诱导Treg细胞的活化，抑制效应T细胞、NK细胞的增殖，因此，IDO1是重要的免疫调节因子。基于IDO1可分解氨酸生成L‑犬尿氨酸，L‑犬尿氨酸在酸性条件下可以与对二氨基苯甲醛(paradimethylaminobenzaldehyde，PDAB)反应，生成对二氨基苯甲醛脲，为柠檬化合物，可通过化学吸光度法测定其含量，即检测其化学反应产物在492nm处吸收光强弱来间接反映间充质干细胞分泌的IDO1的酶代谢活性，从而评价间充质干细胞的免疫调节能力。
[0046] 1.1实验仪器
[0047]本实验所用主要仪器包括：生物安全柜、二氧化碳培养箱、荧光细胞计数仪、酶标仪、恒温培养箱、电子天平等。
[0048] 1.2主要试剂
[0049]本实验所用主要试剂如下：
[0050]间充质干细胞完全培养基
[0051]IFN‑γ
[0052]三(TCA)
[0053]对二甲氨基苯甲醛(PDAB)
[0054]冰乙酸
[0055]L‑犬尿氨酸标准品
[0056] 1.3工作参考品细胞(RSF‑M)
[0057]本实验使用的工作参考品细胞是间充质样干细胞：由人胚干细胞定向分化而来，分化代次为P5代，规格5.03×107个/ml。
[0058] 1.4试剂配制
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议