(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010365032.7
(22)申请日 2020.04.30
(71)申请人 湖南师范大学
地址 410081 湖南省长沙市麓山路36号湖
南师范大学生命科学学院
(72)发明人 陈波 郭萍
(74)专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务
所(普通合伙) 43213
代理人 魏龙霞 杨斌
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/34(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
G01N 30/86(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种替丁类药物中NDMA含量
以下步骤：(1)将替丁类药物样品用液相谱进
行分离；其中，液相谱采用亲水作用谱柱，柱
品结合质谱进行检测NDMA含量。本发明采用的亲
水作用谱分析方法来分离替丁类成分和NDMA，
在柱前流动相中不加酸，使替丁和NDMA维持非离
子型状态而达到分离，使两者分离时间相差12-
13min，因此，能够完全去除替丁类成分对NDMA的
干扰，定量结果准确。本发明使用电喷雾离子化
结合串联质谱，ESI为低温质谱，且质谱部分为非
高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强，
转化应用前景强。权利要求书1页 说明书7页 附图7页CN 111537634 A 2020.08.14
C N 111537634
A
1.一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法，其特征在于，采用液相谱质谱联用检测，包括以下步骤：
(1)将替丁类药物样品用液相谱进行分离；
其中，液相谱采用亲水作用谱柱，柱前流动相中不加酸；
(2)将经液相谱分离的样品结合质谱进行检测NDMA含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱分析采用ESI电喷雾离子源质谱。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，液相谱分析过程中柱前流动相为：流动相A为纯水，流动相B为98％-50％乙腈。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，流动相A与流动相B的体积比为1:1。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，谱柱选择Waters亲水柱、赛默飞亲水柱、安捷伦亲水柱、酰胺柱亲水谱柱中的任一种。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，在柱尾流动相中添加促电离剂，所述促电离剂为甲酸或乙酸；所述促电离剂的浓度范围为1mmol/L -1000mmol/L。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述柱前流动相与柱尾流动相的流速比为(1：10)-(10：1)。
8.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，替丁类药物进样前，配成30mg/mL的乙腈样品溶液并经有机膜过滤；样品进样量为10uL -0.2mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱分析过程中喷雾电压为1.0kV -5.0kV，脱溶剂温度为100-300℃。
10.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，检测NDMA的特征离子对包括定量离子对：75.25/43.05和定性离子对：75.25/58.10。
权 利 要 求 书1/1页CN 111537634 A
一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法
技术领域
[0001]本发明属于分析测试领域，尤其涉及一种检测替丁类药物中NDMA含量的方法。
背景技术
[0002]尼扎替丁为一种在临床上广泛用于高胃酸分泌疾病的药物，是第三代新型H2-受体拮抗剂，与雷尼替丁相似，此类药物中也被检出含有不安全水平的致癌物质NDMA。NDMA，中文全名为N-亚硝基二甲胺，已确定是一种遗传毒性杂质，该物质可在很低浓度时造成人体遗传物质DNA损伤，进而导致基因突变致使肿瘤发生。目前，FDA、EMA、NMPA等药品监管部门发布的药物原料及制剂中NDMA杂质的检测方法主要为：GC-MS(气相谱质谱法)、LC-APCI-MS/MS(液相谱-大气压化学电离串联质谱法)、LC-HRMS(液相谱-高分辨质谱法)等。对于替丁类药物的分析，因为气相谱法的高温进样造成药物结构中的硝基和二甲胺从母核解离，再结合生成新的NDMA而出现假阳性结果，因此GC法无法在替丁类药物测定中使用；液相-质谱法目前采用的是反相液相谱与APCI(大气压化学电离)结合用串联质谱进行检测，或与ESI(电喷雾电离)结合HRMS(高分辨质谱)进行检测。两种方式中的一个共性问题在于反相分离时，替丁类成分与NDMA的分离度有限。为促进后续的电离效率，流动相中添加的助电离剂(有机酸)也进一步减小了成分的分离效果。而且，由于APCI为高温离子源，亦会导致药物自身热裂解产生新的NDMA与样品中残留的NDMA重叠，进而出现假阳性结果，另外，HRMS仪器造价十分昂贵，很大程度上限制了LC-APCI-MS/MS和LC-HRMS的适用性。
发明内容
[0003]本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种仪器造价相对低、应用推广性更强的、灵敏度高、定量结果准确的检测尼扎替丁原料或其制剂中NDMA含量的方法。
[0004]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
[0005]一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法，采用液相谱质谱联用检测，包括以下步骤：
[0006](1)将替丁类药物样品用液相谱进行分离；
[0007]其中，液相谱采用亲水作用谱柱，柱前流动相(进入谱柱的流动相为柱前流动相)中不加酸；
[0008](2)将经液相谱分离的样品结合质谱进行检测NDMA含量。
[0009]上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，质谱分析采用ESI电喷雾离子源质谱。ESI电喷雾离子源质谱的离子源为低温离子源，且质谱部分为非高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强。
[0010]上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，液相谱分析过程中柱前流动相为：流动相A为纯水，流动相B为98％-50％乙腈。流动相A和流动相B可以互换。本发明的申请人发现通过选择98％-50％乙腈水作为流动相，可以让尼扎替丁在亲水作用谱柱上保留时间更长，
从而与NDMA达到完全分离。
[0011]上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，流动相A与流动相B的体积比为1:1。[0012]上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，谱柱选择Waters亲水柱、赛默飞亲水柱、安捷伦亲水柱、酰胺柱亲水谱柱中的任一种。
[0013]上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，在柱尾流动相中添加促电离剂，所述促电离剂为甲酸或乙酸；所述促电离剂的浓度范围为1mmol/L-1000mmol/L。本发明在柱前流动相中先不加酸维持替丁类成分和NDMA为非离子型状态而达到分离，再在柱尾流动相(谱柱出来之后为柱尾)中加酸，即柱前流动相带着样品进入亲水谱柱分离，样品从谱柱分离出来后并与柱尾泵入的酸混合，最后进入质谱检测，这样操作既保证了离子化效率，又不会影响成分的分离效果。
[0014]上述的检测方法，优选的，所述柱前流动相与柱尾流动相的流速比为(1：10)-(10：1)。
[0015]上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，替丁类药物进样前，配成30mg/mL的乙腈样品溶液并经有机膜过滤；样品进样量为10uL-0.2mL。
[0016]上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，质谱分析过程中喷雾电压为1.0kV-5.0kV，脱溶剂温度为100-300℃。
[0017]上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，检测NDMA的特征离子对包括定量离子对：75.25/43.05和定性离子对：75.25/58.10。
[0018]上述的检测方法，优选的，所述替丁类药物为尼扎替丁原料或其制剂。
[0019]目前，在分析药物中NDMA含量的检测时，为了使药物成分和NDMA在谱柱中保留时间更长，选择反相谱柱分离，但反相流动相中水的比例较高，这样就要求质谱仪具有更高的灵敏度，必须使用高温离子源APCI与其匹配。然而，高温离子源APCI价格昂贵，本申请的发明人期望能够利用ESI质谱仪来测定替丁类药物中NDMA含量。基于此，本发明首先在液相谱采用亲水作用谱柱来分离替丁类成分和NDMA，以期与ESI质谱仪相匹配。但是如何利用液相谱分析将替丁类成分和NDMA进行彻底分离开，以更好地利用ESI质谱仪来进行分析，是一直未曾解决的技术问题。本发明的申请人通过反复研究和实验验证发现，在亲水性谱分析过程中柱前流动相中不能加入促电离剂(酸)，并且通过流动相的合理选择，可以使得NDMA与尼扎替丁能够被彻底分离开，能够完全去除替丁类成分对NDMA的干扰，定量结果准确；同时，在柱尾流动相中加入酸，将中性的NDMA转化为离子状态，保证了NDMA离子化效率，在ESI质谱中分析，测试灵敏度高。
[0020]与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0021](1)本发明采用的亲水作用谱分析方法来分离替丁类成分和NDMA，在柱前流动相中不加酸，使替丁类成分和NDMA维持非离子型状态而达到分离，使两者分离时间相差12-13min，因此，能够完全去除替丁类成分对NDMA的干扰，定量结果准确；
[0022](2)本发明在柱尾流动相中加酸，保证了NDMA的离子效率，在ESI质谱测试灵敏度高，本发明的这样操作既保证了NDMA离子化效率，又不会影响替丁和NDMA的分离效果；[0023](3)本发明使用电喷雾离子化结合串联质谱，ESI为低温质谱，且质谱部分为非高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强，转化应用前景强；
[0024](4)本发明的前处理简单，分析时间短，分析一针样品的时间短，不超过20min；且
本发明的申请人在研究过程中发现，采用本发明的分析方法NDMA出峰的保留时间在2min左右，2.5min之后不再出NDMA峰，而替丁类成分则在15min出峰，因此在产业化应用分析的过程中，注样3min后就可以通过阀切换把从液相谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱，质谱污染小；
[0025](5)本发明的检测方法对其它类似原料及制剂中NDMA的测定具有借鉴意义。
附图说明
[0026]图1是1ng/mL NDMA标准溶液通过本发明的检测方法检测后利用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0027]图2是1ng/mL NDMA标准溶液通过本发明的检测方法检测后利用定量离子对(75.25/43.05)分析的
质谱结果。
[0028]图3是采用外标法，以75.25/43.05为定量离子对绘制的NDMA含量的标准曲线。[0029]图4是本发明实施例1中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0030]图5是本发明实施例1中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0031]图6是本发明实施例1中利用液相紫外检测器检测尼扎替丁的紫外光谱图。[0032]图7是本发明实施例2中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0033]图8是本发明实施例2中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0034]图9是本发明实施例3中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0035]图10是本发明实施例3中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0036]图11是本发明对比例1中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0037]图12是本发明对比例1中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0038]图13是本发明实施例4中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0039]图14是本发明实施例4中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0040]图15是本发明对比例2中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
[0041]图16是本发明对比例2中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
[0042]图17是本发明验证柱尾补充促电离剂能提高离子化效率的实验过程中采用定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果。
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