(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202110889036.X
(22)申请日 2021.08.04
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 113577115 A
(43)申请公布日 2021.11.02
(73)专利权人 南昌大学
地址 330000 江西省南昌市红谷滩新区学
府大道999号
(72)发明人 李文娟 万敏 姚于飞 桑婷
卿城 吴伟 潘雨欣
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 龚燮英
(51)Int.Cl.
A61K 36/185(2006.01)
A61P 11/00(2006.01)A61P 29/00(2006.01)A61K 127/00(2006.01)(56)对比文件AU 6030299 A ,2001.04.10AU 2437101 A ,2001.06.25审查员 李博 (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了黄金茶挥发油在制备LPS诱导
急性肺损伤保护药物中的应用，属于医药用途技
术领域，本发明使用实验手段考察了黄金茶挥发
油对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤的保护作用。
黄金茶挥发油显著改善LPS诱导的肺组织病理损
伤；并进一步确认其药理作用是通过恢复LPS所
致白细胞数量减少的现象，降低胸腺和脾脏肿大
程度，下调血清促炎因子的水平，增强抗氧化防
御能力以及提高短链脂肪酸含量实现的。基于黄
金茶挥发油以上新性质，本发明确定了利用其制
备由LPS所诱导的急性肺损伤保护药物的新用
途，其疗效好，毒副作用小，具有良好的前景价
值。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 113577115 B 2022.04.12
C N 113577115
B
1.黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：
所述黄金茶挥发油由山蜡梅嫩叶通过超纯水浸泡、微波处理、水蒸气蒸馏提取、加入无水硫酸钠、干燥步骤制备而成，所述黄金茶挥发油的主要组成为酯类和萜类化合物，按照质量百分比从大至小依次包括(1‑甲基‑4‑丙‑1‑烯‑2‑基环己基)乙酸酯、α‑蒎烯、α‑乙酸松油酯、环氧化蛇麻烯II、伪柠檬烯和右旋大根香叶烯；
所述黄金茶挥发油用于调节LPS损伤条件下血液中白细胞数量至正常水平、降低由LPS 所引起胸腺和脾脏肿大程度、减轻血清中促炎因子IL ‑1β水平、增强肺组织中SOD活性以及降低MDA含量、增强肠道提高短链脂肪酸含量。
2.根据权利要求1所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物用于缓解由LPS所致的全身性炎症损伤。
3.根据权利要求2所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物用于改善LPS诱导的肺组织病理损伤。
4.根据权利要求3所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述
保护药物用于抵抗和缓解由LPS所致急性肺损伤，其通过减轻肺组织结构损伤及炎症细胞浸出实现。
5.根据权利要求1所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物为口服制剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 113577115 B
黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用
技术领域
[0001]本发明属于医药用途技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用。
背景技术
[0002]近年来，由于空气污染加重及人类生活习惯的转变，急性肺损伤的发病率逐年上升，其发病率约为34/10万，死亡率约34％‑58％。急性肺损伤是以肺部急性炎症为特征的一种失控性炎症疾病，是败血症、严重创伤等危重疾病的并发症。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种主要组分，是导致急性肺损伤常见的诱因。因此在本技术中采用腹腔注射LPS建立大鼠急性肺损伤模型。当肺部暴露于LPS
时，LPS可以与细胞表面膜受体(Toll样受体和NOD样受体)结合，并激活炎症反应的相关信号通路，导致促炎细胞因子，如白细胞介素1β(IL‑1β)等过量的产生，促进急性肺损伤的发生和发展。因此，研发具有抗炎作用的药物对急性肺损伤的防治是十分紧急且重要的。
[0003]本实验室黄金茶由山腊梅嫩叶，并制备而成。黄金茶的活性成分繁复，主要含有挥发油、多糖、生物碱、黄酮、香豆素、鲨肌醇、东莨菪苷、异嗪皮啶等物质。挥发油被认为是黄金茶中的主要活性物质之一，从黄金茶挥发油中鉴定出21种化学物质，其中，(1‑甲基‑4‑丙‑1‑烯‑2‑基环己基)乙酸酯的含量达到50.67％，其次是α‑蒎烯(6.92％)、α‑乙酸松油酯(5.77％)、环氧化蛇麻烯II(3.96％)、伪柠檬烯(3.21％)和右旋大根香叶烯(3.12％)等。现代临床实验证实，黄金茶挥发油具有良好的止咳平喘、免疫调节、促进消化、减少体脂等作用。但是有关黄金茶挥发油对LPS诱导的急性肺损伤作用是未见报道。
发明内容
[0004]针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤药物中的应用。
[0005]本发明通过以下技术方案予以实现：
[0006]本发明提供黄金茶挥发油的一种新用途，其用于制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用。
[0007]作为优选，所述保护药物是缓解由LPS所致的全身性炎症损伤。
[0008]作为优选，所述保护药物是改善LPS诱导的肺组织病理损伤实现的。
[0009]作为优选，所述保护药物是通过调节大鼠血液中白细胞数量至正常水平实现的。[0010]作为优选，所述保护药物是通过降低由LPS所引起胸腺和脾脏肿大程度实现的。[0011]作为优选，所述保护药物是通过降低血清和肺组织中促炎因子(IL‑1β)水平实现的。
[0012]作为优选，所述保护药物是增强肺组织中SOD活性以及降低MDA含量实现的。[0013]作为优选，所述保护药物是通过增强肠道提高短链脂肪酸含量实现的。[0014]作为优选，所述保护药物用于抵抗和缓解由LPS所致急性肺损伤，其通过减轻肺组
织结构损伤及炎症细胞浸出实现的。
[0015]作为优选，所述药物药物的剂型是口服剂。
[0016]与现有技术相比，本发明有益效果包括：
[0017](1)本发明考察了黄金茶挥发油对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤的保护作用。黄金茶挥发油显著改善LPS诱导的肺组织病理损伤；并进一步确认其药理作用是通过恢复LPS所致白细胞数量减少的现象，
降低胸腺和脾脏肿大程度，下调血清促炎因子的水平，增强抗氧化防御能力以及提高短链脂肪酸含量实现的。
[0018](2)基于黄金茶挥发油新性质，本发明确定了利用其制备由LPS所诱导的急性肺损伤保护药物的新用途，其疗效好，毒副作用小，具有良好的前景价值。
附图说明
[0019]图1是本发明黄金茶挥发油的总离子流谱图。
[0020]图2是本发明具体实施方式中不同实验组之间血清中WBC含量；
[0021]图3是本发明具体实施方式中不同实验组之间胸腺指数(A)和脾脏指数(B)；[0022]图4是黄金茶挥发油对LPS诱导急性肺损伤模型大鼠肺组织形态学变化的影响；图中CON为正常对照组，LPS为LPS模型组(腹腔注射800μg/kg浓度的LPS水溶液)；DEX组为地塞米松阳性组(腹腔注射5μg/kg浓度的地塞米松磷酸钠水溶液)；在10倍×4倍倒置显微镜下观察组织损伤病变的情况；
[0023]图5是本发明具体实施方式中不同实验组之间血清中IL‑10水平(A)、IL‑1β水平(B)对比图；
[0024]图6是本发明具体实施方式中不同实验组之间肺组织中SOD活力(A)以及MDA含量(B)对比图；
[0025]图7是本发明具体实施方式中不同实验组之间盲肠内容物中短链脂肪酸对比图。
具体实施方式
[0026]下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
[0027]1、实验材料
[0028] 1.1材料与试剂
[0029]黄金茶由江西省婺源县专业合作社栽培采集的山蜡梅嫩叶制备而成。黄金茶挥发油提取通过如下方法所得：称取600g黄金茶。浸泡于超纯水(1∶40，w/v)，微波处理10min，用水蒸气蒸馏提取5小时，加入无水硫酸钠，干燥后得到黄金茶挥发油，并储存在4℃冰箱里。黄金茶挥发油主要为酯类和萜类化合物，其中(1‑甲基‑4‑丙‑1‑烯‑2‑基环己基)乙酸酯的含量达到50.67％，其次是α‑蒎烯(6.92％)、α‑乙酸松油酯(5.77％)、环氧化蛇麻烯II (3.96％)、伪柠檬烯(3.21％)、右旋大根香叶烯(3.12％)等。
[0030]LPS(美国Sigma公司，来源于大肠杆菌055：BS)，地塞米松磷酸钠溶液(河南润弘制药股份有限公司)，大鼠IL‑10、IL‑1B试剂盒购自于武汉博士德公司，SOD、MDA试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。
[0031]实验动物：清洁级大鼠Wistar雄性大鼠，体重180‑200g，资格证号：SCXK(Jing) 2016‑0006。购自于北京维通利华公司。
[0032] 1.2主要仪器设备
[0033]Sysmex XE‑2100全自动血细胞分析仪日本公司；高速台式离心机德国sigma公司；全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标仪)美国Thermo公司；超纯水仪美国Millipore公司；M1‑L201B型微波炉购于美的制冷家电集团；SKM型数显恒温电热套购于山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；生化培养箱上海森信实验仪器公司；Agilent 6890N气相谱系统美国Agilent Technologies公司。
[0034]2、实验方法
[0035] 2.1 GC‑MS分析黄金茶挥发油组成
[0036]精密量取最优工艺条件下制备的黄金茶挥发油7.5μL，加入1.5mL正己烷，并用无水硫酸钠除水，5000r/min离心10min，取上清液得到待测溶液，通过0.22μm有机滤膜过滤后直接进样分析。谱条件：HP‑5MS毛细管谱柱(250μm×30m，0.25μm)，载气为高纯氮气，柱流量为1.0mL·min‑1，进样量为1μL，分流进样，分流比20∶1，进样口温度280℃，升温程序：柱温70℃，保持2min，10℃·min‑1的速率升至100℃，随后以2℃·min‑1的速率升至123℃并保持3min，再以5℃·min‑1的速率升至160℃，10
℃·min‑1的速率升至220℃，2℃·min‑1的速率升至230℃并保持5min。质谱条件：接口温度280℃，电子轰击(EI)能量70eV，离子源温度230℃，MS回级杆温度150℃溶剂延迟7min，全扫描，质荷比20～500amu，通过GC‑MS对黄金茶挥发油进行分析的总离子流谱图如图1所示。结合NIST数据库并查阅文献对挥发油组分进行鉴定，采用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量。
[0037] 2.2动物实验设计
[0038]选取36只健康清洁级大鼠Wistar雄性大鼠，体重180‑200g，资格证号：SCXK(Jing) 2016‑0006。购自于北京维通利华公司。许可证号：SCXK(赣)2018‑0003。大鼠饲养于干燥、通风、安静的环境中，适应性喂养一周。按体重随机分成5组，每组7只，随机分为6组：正常组(CON)、阳性对照组(地塞米松组，DEX，5mg/kg)、模型组(LPS，800μg/kg)、LPS+黄金茶挥发油低剂量(CEOL，25mg/kg)、LPS+黄金茶挥发油中剂量(CEOM，50mg/kg)、LPS+黄金茶挥发油高剂量(CEOH，100mg/kg)。黄金茶挥发油组的大鼠均通过灌胃方式给予前处理7天。正常组和LPS组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5％DMSO。DEX组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5％DMSO最后一天腹腔注射DEX(5mg/kg)。末次灌胃后0.5h，腹腔注射LPS溶液800μg/kg建立急性肺损伤模型，6h后处死，进行各相关指标的测定。
[0039]动物实验过程中选用的DEX(地塞米松)是临床上一种广泛运用抗炎药物，已有大量研究报道，DE
X作为一种糖皮质激素，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，可以有效的减弱LPS所导致的机体损伤，减弱机体过度炎症反应，维护免疫系统的平衡，因此本发明中选用DEX作为阳性对照组是合适的。
[0040] 2.3实验样品采集
[0041]血清样品的制备：腹腔注射LPS溶液造模6h后，用异氟烷进行麻醉。采用眼眶取血，取全血500μL于抗凝管，用于白细胞数量检测。其余血加入10mL离心管中，室温静置2h，以3000r/min，4℃离心分离10min，收集上层血清样本，于‑80℃冰箱保存备用。
[0042]收集大鼠脾脏、胸腺和肺，称重记录，计算脏器指数。
[0043]肺组织病理切片：取约2cm*2em的肺片于盛满10％福尔马林固定液的4mL EP管中，并进行常规梯度脱水、包埋、切片、拷片，HE染，镜下观察组织损伤病变的情况。
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