[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1334878A [43]公开日2002年2月6日
[21]申请号99811155.4[21]申请号99811155.4[22]申请日99.7.21[30]优先权
[32]1998.07.21 [33]GB [31]9815879.3
[32]1998.11.09 [33]US [31]60/107,688
[32]1999.03.23 [33]GB [31]9906712.6
[32]1999.04.01 [33]US [31]60/127,410
[32]1999.04.23 [33]GB [31]9909494.8
[32]1999.05.12 [33]US [31]60/134,016
[86]国际申请PCT/GB99/02357 1999.07.21
[87]国际公布WO00/05393 EN 2000.02.03
[85]进入国家阶段日期2001.03.21[71]申请人科布尔药物有限公司
地址英国基利
[72]发明人迈克尔·安东尼乌 罗伯特·克龙比
[74]专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公
司
代理人丁业平 王维玉[51]Int.CI 7C12N 15/85C12N 5/10C12Q 1/68
A61K 48/00
C12N 15/00A01K 67/027C12N 15/11C12N 15/86
权利要求书 5 页 说明书 96 页 附图 64 页 [54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及具有非衍生于LCR的遍在染质开
放表达元件(UCOE)的聚核苷酸。本发明还涉及具有
在和试验中该聚核苷酸或载体或宿主细胞的使
用以及鉴定UCOE的方法。UCOE能开放染质或使染
质保持在开放状态，并在至少两种不同组织细胞
99811155.4权 利 要 求 书第1/5页 1.一种包含UCOE的聚核苷酸，其开放染质或使染质保持在开放状态，并在至少两种不同组织细胞中促进被操纵连琐基因的可再现表达，其中该聚核苷酸不是从基因座位控制区衍生的。
2.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中该聚核苷酸以非组织特异性的方式促进被操纵连琐基因的可再现表达。
3.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中在有活化基因表达发生的所有组织中该聚核苷酸均促进被操纵连琐基因的可再现表达。
4.根据前述权利要求中任一项所述的聚核苷酸，其中该聚核苷酸促进被操纵连琐基因在生理水平上的表达。
5.根据前述权利要求中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含延长的无甲基化的CpG-岛。
6.根据前述权利要求中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE衍生于其天然内源位置与遍在表达基因相关联的序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含背弛转录的双重或双向启动子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE是一个跨越人TATA结合蛋白(TBP)基因的44kb DNA片段和各12kb的5′和3′侧翼序列；或其功能同源体或功能片段。
个跨越人hnRNP A2基因的60kb DNA片段和5′的30kb及3′的20kb的侧翼序列；或其功能同源体或功能片段。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含图21中在核苷酸1至6264之间的序列，或其功能同源体或功能片段。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含图21中在核苷酸1至5636之间的序列和CMV启动子，或其功能同源体或功能片段。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含图21中在核苷酸4102至8286之间的序列，或其功能同源体或功能片段。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含图21中在核苷酸1至7627之间的序列，或其功能同源体或功能片段。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE包含图21中在核苷酸1至9127之间的序列，或其功能同源体或功能片段。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE是一个跨越人TBP基因的25kb DNA片段和5′的1kb及3′的5kb的侧翼序列；或其功能同源体或功能片段。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE是一个跨越人hnRNP A2基因的16kb DNA片段和5′的5kb及3′的1.5kb的侧翼序列；或其功能同源体或功能片段。
图20或图21所示的核苷酸序列，或其功能同源体或功能片段。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的聚核苷酸，其中UCOE的一个或多个启动子是异源启动子。
19.上述权利要求中任一项所述的聚核苷酸或其片段在鉴定其它UCOE的试验中的应用。
20.一种对在至少两种不同组织细胞中促进被操纵连琐基因可再现表达的UCOE进行鉴定的方法，包括：
(1)用具有候选UCOE的载体通过转染至少两种不同组织的细胞对候选UCOE进行测验，所述候选UCOE被操纵连琐到标记基因上；和 (2)确定是否在两种或更多种组织细胞中能得到该标记基因的可再现表达。
21.一种载体，具有权利要求1-18中任一项所述的聚核苷酸。
22.根据权利要求21所述的载体，其中还具有被操纵连琐到所述聚核苷酸上的可表达基因。
23.根据权利要求21或22所述的载体，其中该载体是游离型载体或整合型载体。
24.根据权利要求21或22所述的载体，其中该载体是质粒。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的载体，其中被操纵连琐的基因是用核酸序列。
26.根据权利要求21所述的载体，其含有图20中在核苷酸1和7627之间的序列、CMV启动子、多克隆位点、聚腺苷酸化序列和在适当调控元件下的编码可选择标记物的基因。
27.一种如图49所示的载体CET200。
28.一种如图49所示的载体CET210。
29.一种用权利要求21至28中任一项所述载体转染的宿主细胞。
30.在中使用的权利要求1至18中任一项所述的聚核苷酸、权利要求21至28中任一项所述的载体或权利要求29所述的宿主细胞。
31.权利要求1至18中任一项所述的聚核苷酸、权利要求21至28中任一项所述的载体或权利要求29所述的宿主细胞在制备在基因疗法中所用的组合物中的用途。
32.一种方法，包括给需要的患者施用有效剂量的权利要求1至18中任一项所述的聚核苷酸、权利要求21至28中任一项所述的载体或权利要求29所述的宿主细胞。
33.一种药物组合物，包括权利要求1至18中任一项所述的聚核苷酸、权利要求21至28中任一项所述的载体或权利要求29所述的宿主细胞以及可药用赋形剂。
34.权利要求1至18中任一项所述的聚核苷酸、权利要求21至28中任一项所述的载体或权利要求29所述的宿主细胞的用途，将其用于细胞培养体系中以获得目的基因产品。
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