(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510080644.0
(22)申请日 2015.02.15
CGMCC No.10432 2014.08.06
C12N 1/20(2006.01)
C02F 3/34(2006.01)
B09C 1/10(2006.01)
A62D 3/02(2007.01)
A23L 5/20(2016.01)
C12R 1/41(2006.01)C02F 101/34(2006.01)A62D 101/28(2007.01)
(71)申请人华东理工大学
地址200237 上海市徐汇区梅陇路130号
(72)发明人周英 唐文娟 叶邦策
(74)专利代理机构上海新天专利代理有限公司
31213
代理人龚敏
(54)发明名称
及其用途
(57)摘要
本发明公开了一种高效降解邻苯二甲酸酯
类PAEs 的根瘤菌属及其应用，该菌从大棚种植
的一个种，命名为Rhizobium sp.LMB-1，保存
在《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(China
General Microbiological Culture Collection
Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.10432。
该菌种具有较高降解常见的邻苯二甲酸酯类
PAEs(DMP，DEP，DBP，DEHP)的能力，在5天内
对100mg/L 的DMP，DEP，DBP，DEHP 这四种常见
PAEs 的降解率分别为99.71％，66.30％，71.54，
54.02％。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页CN 105316251 A 2016.02.10
C N 105316251
A
1.一种以保藏编号为CGMCC NO.10432，保藏于CGMCC的根瘤菌属(Rhizobium sp.)菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其分离得到的新菌种命名为Rhizobium sp.LMB-1。
3.一种获得如权利要求1或2所述菌株的方法，其特点在于包括分离、纯化、诱变或遗传转化CGMCC NO.10432菌株的步骤。
4.一种CGMCC NO.10432菌株的应用，是作为降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的用途。
一株高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的菌株及其用途
发明领域
[0001] 本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的菌种及其应用。 背景技术
[0002] 邻苯二甲酸酯类(Phthalate esters，简称PAEs)是指邻苯二甲酸的酯化衍生物，是塑胶工业中最为
常见的塑化剂，例如用于生产聚氯乙烯(PVC)、聚醋酸乙烯酯、纤维素和聚氨酯等，以此来提高塑料的机械性能和柔韧性。同时PAEs还可以用于油漆、胶水、润滑油、医药、化妆品、农药、食品包装、塑料管材、家具、儿童玩具和浴帘的生产。全球PAEs的年产量可达数百万吨，而且大多数的PAEs并没有以共价键的方式结合到塑料产品的基质中，而是以范德华力或者氢键的方式连接，并能够保留独立的化学性质，它们可以在产品生产、使用以及产品的后处理过程中逃逸到环境中污染环境。近年来，由于塑料制品的广泛使用导致PAEs在环境中无处不在。目前，特别是在一些工业发达的国家，已经从土壤、地表水、饮用水、垃圾场、植物、空气甚至食品中都检测到了邻苯二甲酸酯的存在，PAEs已经成为了全球最为普遍的污染物之一。PAEs在环境中分布广泛，由于其自身的疏水性及低水溶性，能很快进入到沉积环境中。并且它们随着碳链长度的增加，脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高。PAEs极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。
[0003] PAEs一般是无油状粘稠的液体，易溶于有机溶剂和类脂而不易溶于水，在常温下不易挥发。在环境中常见的成分有DMP、DEP、DBP和DEHP等，其化学结构是由一个刚性平面基环和两个可塑的线性脂肪链组成，其化学结构为：
[0004]
[0005] 由于PAEs在塑料制品的生产、使用等过程中很容易释放出来，该类化合物已成为一种全球性的环境有机污染物，在土壤、水体、大气、生物甚至人体中都已发现PAEs的分布。大量研究表明：邻苯二甲酸酯为一种具有致畸、致癌、致突变“三致效应”的环境干扰剂。邻苯二甲酸酯类PAEs的性质稳定，易在环境中沉积，对人呼吸道和皮肤有毒害作用，可诱发很多生物的突变、畸变和癌变，并能通过食物链累积。
[0006] 研究表明，邻苯二甲酸酯类PAEs的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解成为它们从环境中缓慢消失的主要途径，因此高效降解菌的筛选成为修复邻苯二甲酸酯类PAEs 污染的生态系统的关键。
发明内容
[0007] 本发明的目的是针对上述现有降解邻苯二甲酸酯类PAEs存在的难题，提出一株具有高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs能力的根瘤菌属新种，该降解菌从江苏省南京市受邻苯二甲酸酯类PAEs长期污染的
大棚种植土壤样品中分离，具有降解常见几种PAEs的能力。[0008] 本发明的另一目的是提供本发明的可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的应用，其应用是降解苯二甲酸酯类PAEs的用途。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 本发明提供了一种以保藏编号为CGMCC NO.10432，保藏于CGMCC的根瘤菌属(Rhizobium sp.)菌株。该菌株于2014年8月6日保藏于《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。[0011] 本发明所分离得到的新菌种命名为：Rhizobium sp.LMB-1。
[0012] 本发明还提出了一种获得可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的方法，其特点在于包括分离、纯化、诱变或遗传转化CGMCC NO.10432菌株的步骤。
[0013] 本发明还提供了一种CGMCC NO.10432菌株的应用，是作为降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的用途。
[0014] 该降解菌(称LMB-1)经形态、生理生化特性分析和16s rRNA基因序列同源性分析，鉴定为根瘤菌属(Rhizobium sp.)。LMB-1菌株在pH为6，温度37℃能以DEHP为唯一碳源生长，并且对其降解能力达到最高。
[0015] 本发明通过对大棚种植(长期受到塑料薄膜覆盖)土壤样品进行分离、纯化，得到根瘤菌属的一个新种，采用HPLC对降解培养液中的PAEs中残留量进行定量分析，经过反复实验，发现该菌种具有高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的能力，从而实现本发明的目的。[0016] 本发明的可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的筛选：
[0017] 1、土样：采自江苏省南京市长期受邻苯二甲酸酯类PAEs污染的大棚种植土壤；[0018] 2、菌株的富集和分离；
[0019] 将大棚种植土样混匀，称取5g加入到含有100mg/L的DEHP无机盐培养液，30℃，200rpm/min，摇床培养7d，用移液取2mL转接到新鲜的无机盐培养液，传代培养过程中，驯化3代，DEHP的无机盐培养液中DEHP浓度从100mg/L逐步提高到300mg/L；然后从最后一次无机盐培养液(DEHP浓度为300mg/L)中取100μL涂布于无机盐固体平板上(DEHP浓度为300mg/L)，30℃恒温培养箱，数天后，挑取生长良好的单菌落，划线纯化；该降解菌的分类命名为：根瘤菌属(Rhizobium sp.)，于2014年8月6日保藏于《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，其保藏编号为CGMCC NO.10432。
[0020] 所述的无机盐培养液(MSM)的组分及配比为：K2HPO4，5.8g；KH2PO4，4.5g；
(NH
4)
2
SO
4
，2.0g；MgCl
2
，0.16g；CaCl
2
，0.02g；Na
2
MoO
4
·2H
2
O，0.24mg；FeCl
3
，0.18mg；
MnCl
2·2H
2
O，0.15mg，NaOH调节pH至7.0。121℃高压灭菌15min。
[0021] 本发明提供的可高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的鉴定与属性[0022] 1、菌株LMB-1的形态与生理生化特征
[0023] 菌体的形态特性：
[0024] a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Rhizobium sp.LMB-1的细胞为革兰氏阴性短杆菌，细胞较小。为0.5～1.0μm×1.2～3.0μm。
[0025] b.菌落的形态特性：
[0026] 在TSA培养基平板上，37℃培养24h后，菌落呈乳白，圆形，丰满，有光泽，表面光滑凸起，半透明，边缘整齐，直径1.0-2.0mm。
[0027] 表1.菌株LMB-1的主要生理生化特性
[0028]
[0029]
[0030] 注：“+”，阳性；“—”，阴性。
[0031] 2、菌株LMB-1的16S rRNA基因序列(No.KM891589)
[0032] Rhizobium sp.LMB-1的16s rRNA
[0033] TGGTGGCGGCAGGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCG TGGGAACATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATT TATCGGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTG GTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG GACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGAT
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