(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880031841.5
(22)申请日 2018.03.21
(30)优先权数据
62/474,409 2017.03.21 US
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2019.11.13
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/IB2018/051905 2018.03.21
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2018/172961 EN 2018.09.27
(71)申请人 斯蒂利亚诺斯·米夏拉克基斯
地址 德国慕尼黑
申请人 马丁·比尔
(72)发明人 斯蒂利亚诺斯·米夏拉克基斯
马丁·比尔
(74)专利代理机构 北京柏杉松知识产权代理事务所(普通合伙) 11413代理人 王春伟 刘继富(51)Int.Cl.A61K 48/00(2006.01)C12N 15/864(2006.01)
(54)发明名称
疗法
(57)摘要
的多核苷酸，所述启动子包含人感光细胞特异性
启动子元件、核心启动子。此外，本发明提供了包
包含多核苷酸的药物组合物。本发明还涉及质
粒、病毒载体或药物组合物，其用作药物，特别是
用于视网膜疾病。权利要求书4页 说明书46页序列表202页 附图16页CN 111050805 A 2020.04.21
C N 111050805
A
1.一种多核苷酸，其按以下顺序包含：
a)包含人视杆感光细胞特异性启动子元件(hRPSPE)和核心启动子(CP)的启动子，所述启动子元件包含根据SEQ ID NO：1的核酸序列或其变体、基本上由根据SEQ ID NO：1的核酸序列或其变体组成、或由根据SEQ ID NO：1的核酸序列或其变体组成；和 b)与a)的启动子可操作地连接的至少一个转基因(TG)；
其中SEQ ID NO：1的变体包含SEQ ID NO：1的核苷酸第6位至13位、第32位至40位、第70位至83位和第87位至94位之外的一个或多于一个核酸置换。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中hRPSPE的5′端位于SEQ ID NO：2或其变体的核酸第1位至160位，3′端位于SEQ ID NO：2或其变体的核酸第290位至310位。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中CP包含TATA盒和/或起始子(Inr)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子的5′端位于SEQ ID NO：2或其变体的核酸第1位至160位，3′端位于SEQ ID NO：2或其变体的核酸第340位至350位。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述转基因包含编码维持或改善视杆细胞生理功能的蛋白的核酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述转基因：
(i)包含编码人视杆环核苷酸门控通道β亚基(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MY07A
、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或变体的核酸；编码靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA编码其显性失活突变体；和/或编码特异性结合其显性失活突变体的抗体或抗体结合片段的核酸；或(ii)包含编码抑制视杆细胞增殖的蛋白的核酸，所述蛋白优选为毒素；前药转化酶，例如胸苷激酶；细胞周期抑制剂，例如视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21cn＞1、p27KIP1和p57KIP2；包含编码其显性失活突变体的细胞周期抑制剂的mRNA；和/或包含编码其显性失活突变体的细胞周期抑制剂的核酸。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中hCNGB1包含根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41的氨基酸序列、或其变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其包含一个或多于一个另外的选自以下的核苷酸序列元件：
(i)聚腺苷酸化信号(PAS)；和/或
(ii)一个或两个反向末端重复(ITR)序列；和/或
(iii)形成传染性病毒载体，优选腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒载体，特别是单纯疱疹病毒(HSV)载体所必需的病毒核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述聚腺苷酸化信号包含猿猴病毒40 PAS、基本上由猿猴病毒40 PAS组成、或由猿猴病毒40 PAS组成。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述聚腺苷酸化信号包含根据SEQ ID NO：4的核酸或其功能变体、基本上由根据SEQ ID NO：4的核酸或其功能变体组成、或由根据SEQ ID NO：4的核酸或其功能变体组成。
11.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中ITR序列是腺相关病毒(AAV)ITR。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中AAV是AVV血清型2、5、8或9。
13.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述启动子和转基因在其5′端侧接L-ITR，在其3′端侧接R-ITR。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中L-ITR包含根据SEQ ID NO：5的序列或其变体、基本上由根据SEQ ID NO：5的序列或其变体组成、或由根据SEQ ID NO：5的序列或其变体组成，和/或R-ITR包含根据SEQ ID NO：6的序列或其变体、基本上由根据SEQ ID NO：6的序列或其变体组成、或由根据SEQ ID NO：6的序列或其变体组成。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的总长度为5200个碱基或少于520
0个碱基，优选为5100个碱基或少于5100个碱基，更优选为5000个碱基或少于5000个碱基。
16.一种质粒，其包含权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的质粒，其包含根据SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：42至SEQ ID NO：44的核酸序列或其变体。
18.一种病毒载体，其包含权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的病毒载体，其中所述病毒选自AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其变体。
20.权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸、权利要求16或17所述的质粒和/或权利要求18或19所述的病毒载体，其用作药物。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸、权利要求16或17所述的质粒和/或权利要求18或19所述的病毒载体和药学上可接受的载剂。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求15或16所述的质粒和/或根据权利要求17或18所述的病毒载体，其用于视网膜疾病，特别是视网膜变性。
23.根据权利要求22之用途的多核苷酸、质粒和/或病毒载体，其中给药途径选自眼内、眼球内、玻璃体内或视网膜下。
24.根据权利要求22之用途的多核苷酸、质粒或病毒载体，其中所述视网膜变性与遗传突变、置换和/或缺失相关。
25.根据权利要求22之用途的多核苷酸、质粒或病毒载体，其中所述视网膜变性选自夜盲症、失明、视网膜变性、视网膜营养不良和视网膜素变性。
26.根据权利要求23之用途的多核苷酸、质粒或病毒载体，其中所述视网膜素变性是CNGB1相关视网膜素变性或45型视网膜素变性(RP45)。
27.一种多核苷酸，其按以下顺序包含：
a)人视紫红质启动子，其包含根据SEQ ID NO：9的核酸序列或其变体；和
b)与a)的启动子可操作地连接的至少一个转基因(TG)。
28.根据权利要求27所述的多核苷酸，其中所述转基因包含编码维持或改善视杆细胞生理功能的蛋白的核酸。
29.根据权利要求27或28所述的多核苷酸，其中所述转基因：
(i)包含编码人视杆环核苷酸门控通道β亚基(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MY07A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片
段或变体的核酸；编码靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA编码其显性失活突变体；和/或编码特异性结合其显性失活突变体的抗体或抗体结合片段的核酸；或(ii)包含编码抑制视杆细胞增殖的蛋白的核酸，所述蛋白优选为毒素；前药转化酶，例如胸苷激酶；细胞周期抑制剂，例如视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21CIP1、p27KIP1和p57KIP2；包含编码其显性失活突变体的细胞周期抑制剂的mRNA；和/或包含编码其显性失活突变体的细胞周期抑制剂的核酸。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的多核苷酸，其包含一个或多于一个另外的选自以下的核苷酸序列元件：
(i)聚腺苷酸化信号(PAS)；
(ii)一个或两个反向末端重复(ITR)序列；和
(iii)形成传染性病毒载体，优选腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒载体，特别是单纯疱疹病毒(HSV)载体所必需的病毒核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其中所述聚腺苷酸化信号包含猿猴病毒40 PAS。
32.根据权利要求30所述的多核苷酸，其中ITR序列是腺相关病毒(AAV)ITR。
33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中AAV是AVV血清型2、5、8或9。
34.一种病毒载体，其包含权利要求27至33中任一项所述的多核苷酸。
35.根据权利要求34所述的病毒载体，其中所述病毒选自AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其变体。
36.一种在有需要的对象中视网膜变性的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求27至33中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求34或35所述的病毒载体。
37.一种在有需要的对象中视网膜素变性的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求27至33中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求34或35所述的病毒载体。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述多核苷酸或病毒载体包含SEQ ID NO：43所示的核酸序列。
39.一种在有需要的对象中视网膜变性的方法，其中所述视网膜变性的特征在于对象的视网膜细胞中CNGB1存在缺陷或缺失，所述方法包括向对象施用有效量的包含SEQ ID NO：43所示核酸序列的病毒载体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述视网膜变性是CNGB1相关视网膜素变性或45型视网膜素变性(RP45)。
41.一种在有需要的对象中CNGB1相关视网膜素变性或45型视网膜素变性(RP45)的方法，所述方法包括向对象视网膜下施用有效量的包含SEQ ID NO：43所示核酸序列的病毒载体。
42.一种多核苷酸，其按以下顺序包含：
a)包含人视杆感光细胞特异性启动子元件(hRPSPE)和核心启动子(CP)的启动子，所述启动子元件包含根据SEQ ID NO：1的核酸序列或其变体；和
b)编码人视杆环核苷酸门控通道β亚基(hCNGB1)的转基因，其与a)的启动子可操作地连接，
其中SEQ ID NO：1的变体包含SEQ ID NO：1的核苷酸第6位至13位、第32位至40位、第70位至83位和第87位至94位之外的一个或多于一个核酸置换。
43.一种包含多核苷酸和药学上可接受的载剂的药物组合物，所述多核苷酸按以下顺序包含：
a)包含人视杆感光细胞特异性启动子元件(hRPSPE)和核心启动子(CP)的启动子，所述启动子元件包含根据SEQ ID NO：1的核酸序列或其变体；和
b)编码人视杆环核苷酸门控通道β亚基(hCNGB1)的转基因，其与a)的启动子可操作地连接；
其中SEQ ID NO：1的变体包含SEQ ID NO：1的核苷酸第6位至13位、第32位至40位、第70位至83位和第87位至94位之外的一个或多于一个核酸置换。
44.一种包含病毒载体和药学上可接受的载剂的药物组合物，所述病毒载体包含SEQ ID NO：43所示的核酸序列。
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