(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510833618.0
(22)申请日 2015.11.25
(83)生物保藏信息
CCTCC NO： P201519 2015.11.03
(71)申请人 华中农业大学
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山
街1号
(72)发明人 金双侠 涂礼莉 张献龙
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001
代理人 张红兵
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
A01H 1/02(2006.01)
A01H 4/00(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉
及一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。
通过再生能力比较筛选获得农艺性状优良的棉
花转基因受体材料Y668，以Y668为受体转GFP基
因获得的分离体T1代中的阴性单株Null为组
织培养受体材料，经过连续两次的体细胞再生获
得R2体，最后经过典型单株选择、自交获得再
生能力比亲本提高3倍的转化受体材料Jin 668。
本发明还公开了Jin 668在棉花转基因中的应
用。以本发明培育的Jin668作为转基因受体材
料，将多个抗虫、提高油份的基因导入棉花宿主
细胞，
得到表达外源基因的转基因棉花植株。权利要求书2页 说明书10页 附图4页CN 106801065 A 2017.06.06
C N 106801065
A
1.一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法，其特征在于，包括下列步骤：
A、在愈伤组织诱导阶段，利用含有IBA+KT和2,4-D+KT两种不同的激素组合的愈伤诱导培养基对棉花植株的再生能力进行评估，测定愈伤诱导效率、愈伤增殖速度、愈伤质量以及愈伤分化时间和效率，得到再生能力超过棉花组织培养模式材料珂字棉棉310、棉312和泗棉3号的优良基因型Y668，将所得的棉花品种Y668作后续驯化试验；
B、利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花品种Y668，获得T0转基因后代，使T0转基因植株自交获得T1代分离体，选择T1体中的阴性单株作为下一步驯化对象；
C、对R0代阴性分离单株进行连续两次的再生试验，依次获得R1，R2体，在R1,R2世代中，以棉花品种Y668为对照，剔除农艺性状有变异的株系，在驯化的R1，R2体中保留原始品种的典型农艺性状，通过R2体自交得到保藏编号为CCTCC NO：P201519的转基因受体材料Jin668。
2.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法，其特征在于，步骤B中所述的农杆菌介导的遗传转化方法是指以绿荧光蛋白GFP为报告基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株T0，具体步骤如下：
(1)选择饱满、健康的Y668棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次，将灭菌后的Y668棉花种子接种于无菌苗萌发培养基上，在28℃黑暗条件下于恒温箱中培养4-6d后，取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段，接种于0.5OD的用农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染10mim
后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液，将下胚轴接种在共培培养基的培养皿中，在21℃，黑暗条件下共培养2天，最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍，吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代1次；
(2)将步骤(1)所得的愈伤组织转到分化培养基中，至产生体细胞胚及幼苗；
(3)将步骤(2)所得的体细胞胚及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中，直至获得再生植株；
(4)将步骤(3)所得的再生植株进行水培、驯化处理，然后移栽到温室土钵中；
(5)将步骤(4)获得的再生植株进行PCR和荧光检测鉴定，筛选获得阳性单株，通过使阳性植株自交获得分离体，再通过荧光检测和PCR方法，鉴定出T1体的中阴性分离单株，使其自交后获得R0体；
其中：
用于鉴定阳性植株的PCR的引物序列如下：
GFP-正向引物：GTT CTC TGG ATC CAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA G，
GFP-反向引物：GAT CTT CTC TTG GAC AGC TCG TCC ATG CCG；
PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性1min,63℃退火1min,72℃延伸1.5min，重复30循环；72℃延伸10min；4℃保存；
用于转基因植株的GFP荧光检测的步骤如下：分别从再生材料的不同组织，器官切取后，置于体式荧光显微镜下检测GFP基因的表达情况；
(6)以获得的R0代体为转化受体，通过连续组织培养对R0代体进行再生2次，选择典型的R2体进行自交，得到转基因受体材料Jin668，具体步骤如下：
1)选择饱满、健康的R0植株的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次，接种于无菌苗萌发培养基上，黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6d，取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段，接种于DK愈伤诱导培养基中，每月继代一次，共继代2-3次；
2)将所得的愈伤组织转移到到分化培养基中，至产生体细胞胚胎及幼苗，将所得的体细胞胚胎及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中至获得再生植株，从再生植株上收获种子命名为R1体；
3)重复步骤2)的再生过程，获得R2体，
4)对R1体、R2体内的每个株系进行农艺性状考察，保留有原始亲本主要农艺性状的株系，其余的予以淘汰，最终选择得到保持原始品种的典型农艺性状、再生能力和转化效率高的R2体，即Jin66；
上述培养中的培养基的组分及配比：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖和2.5g/Lphytagel；
DK愈伤诱导培养基：MS无机盐+B5维生素，24-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose和0.3％Phytagel；
IK愈伤诱导培养基:MS无机盐+B5维生素，IBA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose和0.3％Phytagel；
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L和甘氨酸1.0g/L；pH5.6；
共培养培养基：MS+B5维生素，2，4-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose和0.25％Phytagel；pH5.6；
选择培养基：MS无机盐+B5维生素，2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L；pH 5.9；
分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3，将KNO3用量加倍+Gln 1.0g/L+Asn 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.9；
胚萌发及成苗培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖和2.5g/L的Phytagel。
一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。
背景技术
[0002]一个成功的棉花的遗传转化体系依赖于高效稳定的转化和植株再生过程。随着农杆菌介导的遗传转化和基因转化的广泛应用，棉花的转化技术日益成熟，转基因抗虫棉也取得了巨大的成功，但是转化细胞的再生的频率和受体棉花基因型的限制仍是棉花转基因的最重要限制因素。前期研究表明棉花组织培养植株再生的途径主要是通过两种途径：一是器官发生途径，二是体细胞胚胎发生途径。目前，体细胞胚胎发生是棉花植株再生的主要途径。
[0003]棉花野生种克劳茨基棉最早实现了胚胎发生，但当时没有能得到再生植株。1983年Davidonis等在继代了两年的陆地棉珂字310的胚性愈伤组织中得到了再生植株。其它研究者也报道了成功的棉花体细胞胚胎发生和植株再生。Trolinder et al(1987)通过硝酸钾加倍和悬浮培养等改进技术，得到了一个简单高效的再生程序。但这种方法比较适用于珂字棉系列，而且再生的植株会有一定程度上的细胞学和形态
学的变异。陈志贤等(1987)等将Trolinder的技术引入中国，成功的再生了多个国内品种。张家明和孙济中(1994)，张家明和张献等(1997)研究发现具有胚胎发生能力的品种具有较为明显的地域性特征，黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。Sun et al(2006)成功再生了多个野生棉材料，并从珂字201的六种外植体分离的原生质体通过体细胞胚胎发生得到了再生植株(Sun et al.,2005)。早期研究表明影响体细胞胚发生和植株再生的因素的主要因素如下：包括外植体类型，激素组合，基因型，培养方式等。其中基因型的影响对棉花体细胞胚胎发生和植株再生能力具有决定性作用。在棉属不同棉种间体细胞胚胎发生和植株再生能力差异很大。有人对多个棉种进行了比较，发现只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞胚(董合忠等，1990)。董合忠和陈志贤(1991)比较了4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差。棉属共有50个种，其中46个野生种，4个栽培种，而到目前为止仅克劳茨基棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉、夏威夷棉、旱地棉、戴维逊棉、雷蒙迪棉、阿拉伯棉等10个种获得了体细胞胚，其中克劳茨基棉、阿拉伯棉、陆地棉、海岛棉、旱地棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。
[0004]张献龙等(1991)认为，材料的基因型对棉花体细胞胚胎发生与植株再生的影响是第一位的，激素类型及其使用浓度则是第二位的。目前，陆续有难再生的基因型棉种体细胞培养成功的报道(Mishra et al.,2003；Wu et al.,2004)。Sakhanokho等(2001)报道了海岛棉(Pima)植株再生。也有草棉(G.herbaceum L.)胚性愈伤组织产生的报道(Jayashanker et al.,1991a)，这是二倍体栽培种。Sun等(200
3)得到野生棉G.klotzschianum再生植株，并按照这个培养过程，通过选择不同的激素组合，高盐离子胁迫，不同碳源组合等调控手段，先后观察了多个野生棉的体细胞胚胎发生，并且用悬浮培养和外界胁迫等方法得到多
个野生棉的再生植株(Sun et al.,2006)。在体细胞胚发生和植株再生能力上，陆地棉棉花品种间也存在着差异。Trolinder and xhixian(1988)对陆地棉28个品种进行了研究，结果表明只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚发生能力，而其他品种较难或不能进行体细胞胚发生。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉、岱字棉、鲁棉、冀棉系列品种获得了体细胞胚和再生植株。
[0005]虽然目前关于棉花再生的报道有几十例，但能够获得再生植株的基因型多数为生产上淘汰的老品种，主要是以珂子棉及其衍生材料，如泗棉三号等，直接利用的价值不大，以这些老品种为转化受体获得的转基因材料要通过杂交和多代回交，才能够在生产上利用，大大降低了转基因育种的利用价值，而且由于再生时间很长，体细胞变异很严重，再生植株中畸形苗比例增加，严重影响转化的效率。
[0006]因此筛选再生能力强、容易重复且农艺性状优良的基因型，是开展转基因育种的重要条件。从2004年开始，华中农业大学棉花课题组先后对100多个份陆地棉，亚洲棉材料进行再生能力的比较，希望能够筛选到高体细胞胚胎发生能力基因型，为棉花转基因育种提供优良的遗传转化受体材料。经过努力筛选到一个再生能力极强的陆地棉材料YZ-1(Jin et al.,2006)，目前这个材料已经被美国德州，德州农
工大学，美国克莱门森大学，中国的河北大学，石河子大学，中国种子集团公司，大北农集团等大学、研究机构及种子企业引入，受到广泛好评。以Y Z-1为转化受体发表的研究论文超过20篇，其中包括N a t u r e Communication,Plant Physiologic,Plant Journal等国际知名杂志。YZ-1具有超鸡脚叶，无腺体，无棉酚等特点，转化周期短，成苗率极高，是棉花基础研究的理想模式材料。但因为YZ-1的农艺性状一般，转基因材料不能直接用于生产实践，无疑制约了这个材料的应用潜力。因此申请人近年把研究重点转移到另外一个陆地棉受体材料，前期的筛选发现豫668 (又称Y668)再生能力也很强，要明显优于珂字棉和泗棉3号等材料，但仍然逊于YZ-1.因此，申请人开始尝试另外一种研究策略提高Y668的再生及转化效率，并取得重要进展。Y668是近年才选育的棉花品种，产量高，纤维品质好，综合农艺性状优良，经过申请人多年的驯化培养，获得的J668材料，完全保留了母本Y668的优良农艺性状，同时显著地提高其再生能力，这一培育过程正是本发明的主要内容。本发明涉及一个棉花优良受体基因型的驯化，培育过程，通过多个基因的转化实验证明，该基因型具有转化效率高，再生植株体细胞变异小，转基因后代遗传稳定等优点。申请人认为利用本发明对提高棉花的遗传转化效率，缩短转基因材料进入育种体系的进程，对棉花转基因基础理论和实践应用都具有重要价值。
发明内容
[0007]本发明的目的在于克服棉花现有遗传转化过程中存在的基因型老化、转化效率低，转化周期长等缺陷，提供一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。
[0008]本发明通过组织培养以及遗传转化试验对不同的棉花品种再生能力先进行初筛，通过多次离体再生和杂交驯化方法培育出一个遗传转化效率高、再生频率好的棉花基因型材料，该棉花基因型材料是一种良好的转基因材料，申请人将这个基因型材料命名为Jin 668，于2015年11月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：P201519，与该基因型材料Jin 668与其原始亲本Y668相比，其转化再生效率提高了3倍，分化时间缩短了约20天。利用Jin 668为转化受体，已将10个不同功能的的基因
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议