(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151123.8
(22)申请日 2019.02.28
(83)生物保藏信息
CGMCC No.17228 2019.01.24
(71)申请人 大连大学
地址 116622 辽宁省大连市开发区学府大
街10号
(72)发明人 张庆芳 胡善松 迟乃玉 刘春莹
李美玉
(74)专利代理机构 大连八方知识产权代理有限
公司 21226
代理人 朱秀芬
(51)Int.Cl.
C12N 9/04(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
其制备方法
(57)摘要
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种产
低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其制备方法。
产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌是以
CGMCCNO.17228为出发菌株，通过基因合成获得
基因，并构建表达载体pET28a -GOD，将表达载体 倒入大肠杆菌BL21构建获得所述的产低温葡萄
糖氧化酶的基因工程菌E.coli BL21/pET28a。本
发明还提供了所述产GOD的基因工程菌用于发酵
生产GOD的应用。构建一种能大幅提高低温葡萄
糖氧化酶产量、缩短发酵时间的基因工程菌，从
而解决了现有野生菌株活力低，发酵时间长等缺
点，
具有广泛的工业应用前景。权利要求书1页 说明书4页序列表2页 附图2页CN 109880809 A 2019.06.14
C N 109880809
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109880809 A
1.一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌，其特征在于，所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌是将菌株CGMCC NO.17228的低温葡萄糖氧化酶基因导入大肠杆菌BL21构建获得。
2.一种如权利要求1所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌用于发酵生产低温葡萄糖氧化酶的应用。
3.一种低温葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征在于，通过发酵生产权利要求1的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌获得低温葡萄糖氧化酶。
4.一种如权利要求1所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是以CGMCC NO.17228为出发菌株，经比对获得菌株CGMCC NO.17228的低温葡萄糖氧化酶基因，通过基因合成获得基因，并构建表达载体pET28a-GOD，将表达载体倒入大肠杆菌BL21构建获得所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌E.coli BL21/pET28a。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、获得目的序列：CGMCC NO.17228为出发菌株，测序的cDNA，与现有低温葡萄糖氧化酶基因比对得到原始低温葡萄糖氧化酶基因；
步骤二、克隆载体构建：对出发菌株的低温葡萄糖氧化酶基因进行基因全长合成并构建于克隆载体pMD-9-T，命名pMD-9-T-GOD；
步骤三、目的基因扩增：用下述引物以pMD-9-T-GOD为模板进行PCR扩增，PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定纯度和分子量的大小，PCR产物经DNA回收试剂盒回收；
5'端引物序列P1为：5'-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3'，
3'端引物序列P2为：5'-CTAGGCACTTTTGGCA-TAGTCTTCA-3'
步骤四、重组质粒pET28a-GOD的构建：PCR克隆菌株CGMCCNO.17228的低温葡萄糖氧化酶基因，连接到pET28a(+)中构建重组质粒pET28a-GOD，用酶NdeI、XbaI同时酶切低温葡萄糖氧化酶基因和载体pET28a(+)，将酶切回收产物用T4DNA连接酶连接起来，构成重组质粒pET28a-GOD；
步骤五、重组菌株E.coli BL21/pET28a的构建：将步骤四获得的重组质粒pET28a-GOD 电转化导入到大肠杆菌BL21中，阳性转化子，即为所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌E.coli BL21/pET28a。
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