(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010067127.0
(22)申请日 2020.01.20
(71)申请人 福建农林大学
地址 350000 福建省福州市仓山区上下店
路15号
(72)发明人 陈建清 刘悦滢 宋娟娟 王腾云
张忆琳 陈清西
(74)专利代理机构 厦门智慧呈睿知识产权代理
事务所(普通合伙) 35222
代理人 杨唯
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
G16B 20/00(2019.01)
G16B 30/00(2019.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明提供一组草莓果实qRT -PCR内参基因
及其引物和应用，具体涉及9个可用于广泛草莓
因，其中内参基因组合RPT6A和RPN5A可作为最优
内参组合用于广泛草莓品种花托发育过程中基
因表达分析。本发明基于基因组和转录组筛选出
的9个新内参在草莓花托发育过程中表达稳定度
优于目前使用的内参基因(26-18S rRNA ,Actin
和GAPDH )；从9个新内参中开发了一对RPT6A和
RPN5A内参组合，用于草莓花托发育过程中基因
表达均化效果最佳；9个新内参及所开发的RPT6A
和RPN5A内参组合可应用于广泛草莓品种的花托
发育过程的基因表达研究。权利要求书1页 说明书12页序列表7页 附图21页CN 111118199 A 2020.05.08
C N 111118199
A
1.一组草莓果实qRT -PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RPT6A基因、RPN5A基因、ATPE基因、ATPD基因、SKP1基因、AKR2B基因、VPS32基因、YLS8基因、UBC12基因；RPT6A基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；RPN5A基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示；ATPE基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；ATPD基因转录本如序列表SEQ ID NO：4所示；SKP1基因转录本如序列表SEQ ID NO：5所示；AKR2B基因转录本如序列表SEQ ID NO：6所示；VPS32基因转录本如序列表SEQ ID NO：7所示；YLS8基因转录本如序列表SEQ ID NO：8所示；UBC12基因转录本如序列表SEQ ID NO：9所示。
2.一组草莓果实qRT -PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RPT6A基因、RPN5A基因；RPT6A基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；RPN5A基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1或2中任何一项所述的内参基因在草莓花托发育过程qRT -PCR中的应用。
4.一种如权利要求1所述的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)候选内参基因基于第四代森林草莓基因组和草莓花托发育相关转录组分析获得；(2)利用转录组数据检测候选内参基因在草莓花托发育过程中表达稳定性；(3)利用RT -qPCR分析验证候选内参基因在草莓花托发育过程中表达稳定性。
5.根据权利要求4所述的内参基因的筛选方法，其特征在于，步骤(1)包括：(1)定义在草莓花托qRT -PCR研究中使用的内参基因包括：26-18S rRNA，ACT6，和GAPDH4.1为常用内参基因；(2)获取公开可用的草莓果实发育过程RNA -seq数据，从NCBI上收集到了9个数据集，总共80个转录组数据；(3)以FPKM值≥100，CoV值≤0.15的标准，在转录组数据中筛选筛选候选内参基因。
6.根据权利要求4所述的内参基因的筛选方法，其特征在于，步骤(2)包括：(1)以每个候选内参基因的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到该候选内参基因在果皮中的相对表达量；(2)依据候选内参基因在在转录组数据中变异度，对候选内参基因进行表达稳定性排序；随后使用RankAggreg程序，融合所有排序，得到一个综合排序，对其稳定度进行综合性评估；(3)利用geNorm软件，利用稳定值M评估基因表达的稳定度，对候选内参基因的所有RNA -seq数据进行分析获得稳定度排行。
7.根据权利要求4所述的内参基因的筛选方法，其特征在于，步骤(3)包括：(1)分析候选内参基因在qRT -PCR实验中的起跳阈值；(2)通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度、稳定性、标准差和变异度和几何平均值；(3)通过geNorm软件对候选内参基因进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因组合个数。
权 利 要 求 书1/1页CN 111118199 A
一组草莓果实qRT-PCR内参基因及其引物和应用
技术领域
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及9个可用于广泛草莓品种花托发育过程中基因表达分析的新内参基因，其中内参基因组合RPT6A和RPN5A可作为最优内参组合用于广泛草莓品种花托发育过程中基因表达分析。
背景技术
[0002]八倍体草莓(Fragaria ananassa,F.ananassa)是全球最重要的水果之一。由于二倍体森林草莓(Fragaria vesca,F.vesca)已完成基因组测序和易遗传转化性，因此被作为八倍体草莓和其他蔷薇科果树的模式植物。果实发育进程分为果实膨大的早期阶段和成熟阶段。从植物学角度看，草莓果实由瘦果和膨大的花托(果肉)组成的聚合果。膨大花托变成草莓的肉质部分，是草莓主要的食用部分。因此，果实特别是花托发育的调控机制是广大植物学家们和育种工作者共同关心的一个问题。在研究这一机制过程中，需要从广泛而全面的分子层面进行研究。基因表达定量分析是解决复杂的基因网络调控的主要突破口。由于实时荧光定量PCR (Reverse transcription–quantitative real time PCR,RT-qPCR)的特异性、精确性和可重复性，其被作为分析基因表达的首要方法，精确的均化是获得可靠的RT-qPCR结果的基础。因此，这个方法需要稳定表达的内参基因(Reference Genes，RGs)对靶基因进行数据均化，未能使用合适的RGs可能导致真实的基因表达量出现偏差和低重复率。
[0003]由于看家基因(House Keeping Genes，HKGs)在细胞中的基础作用和稳定的表达水平, 常被用于均化目的基因表达量的RGs。迄今为止，在草莓果实的RT-qPCR研究中，最常用的三个传统HKGs是26-18S rRNA、Actin、GAPDH。然而，传统的HKGs，包括这三个正在使用的草莓HKGs并没有经过系统验证其稳定性，仅仅是基于它们在任何条件下都有恒定的表达水平的假设，就被应用于草莓果实的研究。越来越多的证据表明，在一定条件下，包括在不同的发育阶段，传统HKGs的稳定性会有相当大的波动。例如，在发育过程中，传统的HKGs 在种子和花粉中出现了较高的变异系数CoV值(衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越高表达越不稳定)。因而，在所研究的实验体系中对RGs进行合适的综合评估是十分必要的。所以，研究人员开发了geNorm、BestKeeper、NormFinder和Delta CT等软件，用于统计分析以筛选出表达最稳定的RGs。在前人的研究中，已对草莓果实发育中的13个候选HKGs进行了评估，并筛选出FaRIB413(26-18S rRNA)和FaACTIN作为最合适的RGs；但遗憾的是，这一结果局限于候选RGs的范围和候选RGs选择的合理化。
[0004]转录组分析广泛应用于植物中研究复杂的分子机制。RNA-seq作为一种全局性的评估技术，以其大数据集、高分辨率和敏感性的优势提供了一个极具代表性的样品转录组快照。利用RNA-seq数据集来筛选在不同条件下稳定表达的理想RGs，已成功应用在拟南芥、水稻和大豆等几种植物中。到目前为止，草莓果实发育的研究已产生的大量RNA-seq数据集，这为筛选果实发育过程的最理想RGs提供了丰富的资源。
[0005]现有技术存在的问题：
[0006]目前，草莓花托研究所用的内参主要以26-18S rRNA,Actin和GAPDH，这三个传统看家基因作为单内参在花托发育过程中用于均化目标基因表达量。
[0007]主要缺陷在于：
[0008]1)这些传统内参在草莓花托发育研究中的应用，仅是参考其他物种，而没有在基因组范围下进行系统的表达稳定度比较验证，而且多个研究发现这些传统内参在其他物种的组织发育过程中表达不稳定；
[0009]2)目前草莓花托发育过程中基因表达研究仅使用单内参进行均化，缺乏更精准的多内参组合应用；
[0010]3)缺乏一种合适的内参基因体系在广泛草莓品种范围内花托发育基因表达研究中使用。
[0011]因此，有必要尽快基于广泛的转录组数据，在全基因组范围下确立一种合适的内参基因体系以解决草莓花托发育过程中传统内参稳定性差，基因表达量均化效果不理想的问题。
发明内容
[0012]本发明要解决的关键技术问题在于提供一组草莓花托发育过程稳定内参基因及其应用。
[0013]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0014]一组草莓果实qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RPT6A基因、RPN5A基因、ATPE 基因、ATPD基因、SKP1基因、AKR2B基因、VPS32基因、YLS8基因、UBC12基因；RPT6A 基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；RPN5A基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示； ATPE基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；ATPD基因转录本如序列表SEQ ID NO：4 所示；SKP1基因转录本如序列表SEQ ID NO：5所示；AKR2B基因转录本如序列表SEQ ID NO：6所示；VPS32基因转录本如序列表SEQ ID NO：7所示；YLS8基因转录本如序列表 SEQ ID NO：8所示；UBC12基因转录本如序列表SEQ ID NO：9所示。
[0015]上述9个基因可用于广泛草莓品种花托发育过程中基因表达分析的新内参基因，其中内参基因组合RPT6A和RPN5A可作为最优内参组合用于广泛草莓品种花托发育过程中基因表达分析。
[0016]一组草莓果实qRT-PCR内参基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)候选内参基因基于第四代森林草莓基因组和草莓花托发育相关转录组分析获得；(2)利用转录组数据检测候选内参基因在草莓花托发育过程中表达稳定性；(3)利用RT-qPCR分析验证候选内参基因在草莓花托发育过程中表达稳定性。
[0017]优选的，上述内参基因的筛选方法步骤(1)包括：(1)定义在草莓花托qRT-PCR研究中使用的内参基因包括：26-18S rRNA，ACT6，和GAPDH4.1为常用内参基因；(2)获取公开可用的草莓果实发育过程RNA-seq数据，从NCBI上收集到了9个数据集，总共80个转录组数据；
(3)以FPKM值≥100，CoV值≤0.15的标准，在转录组数据中筛选筛选候选内参基因。[0018]优选的，上述内参基因的筛选方法步骤(2)包括：(1)以每个候选内参基因的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到该候选内参基因在果皮中的相对表达量；(2) 依据候选内参基因在在转录组数据中变异度，对候选内参基因进行表达稳定性排
序；随后使用RankAggreg程序，融合所有排序，得到一个综合排序，对其稳定度进行综合性评估；(3) 利用geNorm软件，利用稳定值M评估基因表达的稳定度，对候选内参基因的所有RNA-seq 数据进行分析获得稳定度排行。
[0019]优选的，上述内参基因的筛选方法步骤(3)包括：(1)分析候选内参基因在qRT-PCR 实验中的起跳阈值；(2)通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度、稳定性、标准差和变异度和几何平均值；(3)通过geNorm软件对候选内参基因进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因组合个数。[0020]有益效果：
[0021](1)基于基因组和转录组筛选出的9个新内参在草莓花托发育过程中表达稳定度优于目前使用的内
参基因(26-18S rRNA,Actin和GAPDH)；
[0022](2)从9个新内参中开发了一对RPT6A和RPN5A内参组合，用于草莓花托发育过程中基因表达均化效果最佳；
[0023](3)9个新内参及所开发的RPT6A和RPN5A内参组合可应用于广泛草莓品种的花托发育过程的基因表达研究。
附图说明
[0024]图1草莓果实构造图
[0025]从植物学角度，草莓果实由瘦果和膨大的花托(果肉)组成的聚合果。
[0026]图2草莓Actin基因家族鉴定
[0027]图中，森林草莓第四代基因组中共鉴定出6个Actin基因。本发明采用最大似然法(ML) 构建草莓和拟南芥Actin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00022的结构域在草莓和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。 FaACT1(基因登入号：AB116565)是草莓果实qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At 代表拟南芥，Fve代表草莓，aa为氨基酸单位。
[0028]图3草莓GAPDH基因家族鉴定
[0029]图中，森林草莓第四代基因组中共鉴定出6个GAPDH基因。本发明采用最大似然法(ML) 构建草莓和拟南芥GAPDH基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF02800和 PF00044的结构域在草莓和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。FaGAPDH1(基因登入号：AB363963)是草莓果实qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Fve代表草莓，aa为氨基酸单位。
[0030]图4草莓Tublin基因家族鉴定
[0031]图中，森林草莓第四代基因组中共鉴定出13个Tublin基因。本发明采用最大似然法(ML) 构建草莓和拟南芥Tublin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为P F00091和 P F03953的结构域在草莓和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。在Amil-Ruiz等研究中，应用了多个Tubulin基因进行比较，因此我们没有标注其研究中使用的成员。图中，At代表拟南芥，Fve代表草莓，aa 为氨基酸单位。
[0032]图5草莓EF1α基因家族鉴定
[0033]图中，森林草莓第四代基因组中共鉴定出3个EF1α基因。本发明采用最大似然法
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议