(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911101929.2
(22)申请日 2019.11.12
(71)申请人 陈洪亮
地址 364000 福建省龙岩市新罗区东肖镇
后田村下洋尾路38号
(72)发明人 陈洪亮
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)
G16B 30/10(2019.01)
G16B 40/00(2019.01)
(54)发明名称
(57)摘要
一种产前亲权关系鉴定的方法，利用环化扩
增放大仅仅只需提供母亲外周10ul -1.2ml血浆，
在母亲外周血浆中提取的游离DNA已经包含了胎
儿的游离DNA，所以母亲和胎儿只需一份样品即
量少，因此不会对孕妇和胎儿造成创伤，且孕10
周后即可鉴定。权利要求书2页 说明书13页CN 110724732 A 2020.01.24
C N 110724732
A
1.一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
步骤二，提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA ；
步骤三，样品DNA的片段制备；
步骤五，测序；
步骤六，测序数据后处理，并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点；
步骤七，将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP 位点进行对比，最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点，最高碱基类型不同则将该位点定义为一个否定位点，统计出肯定位点和否定位点的数目；
步骤八，根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
2.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤三具体包括：环化样品DNA，消化环化到的环化产物，扩增消化到的循环核酸，并打断扩增到的循环核酸。
3.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤五中所述测序为高通量测序。
4.根据权利要求3所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤四包括：扩增含有SNP 位点的片段，纯化扩增到的PCR 产物，并将PCR 产物末端修复，筛选得到平末端DNA 片段，接头连接，得加接头的DNA 片段，PCR 扩增及纯化得到小片段文库，检测小片段文库的文库浓度和片段大小。
5.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤五中所述测序为Nanopore测序。
6.根据权利要求4所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤五包括：
打开Nanopore测序仪启动口，检查阀盖下是否有小气泡；
步骤四所获得的样品DNA片段准备和加样SpotON flow cell：准备priming mix：将RBF， Nuclease-free water混匀后，吸800ul注入到priming port，室温静置5min；文库准备：RBF， LLB ，Nuclease-free water ，DNA library混匀后，吸取75ul滴入进样孔，盖上盖子，准备测序：
根据MinKNOW指示运行程序，进行测序；
从nanopore测序仪上获得fastq测序结果的文件；
将上步每一条长序列得到的多条短序列采用多对齐算法，彼此对齐，校准碱基。
7.根据权利要求5所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤四包括：将样品DNA片段末端修复，筛选及纯化得到粘性末端，接头连接，得加接头的DNA 片段，将加接头的DNA 片段进行筛选及纯化得待测序DNA。
8.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血或孕妇白细胞样本。
9.根据权利要求7所述的一种产前亲权关系鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血时，需采10ul-1.2ml血浆，再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离
DNA。
一种产前亲权关系鉴定的方法
技术领域
[0001]本发明涉及亲权鉴定领域，尤其是涉及一种能利用少量血浆进行有效产 前亲权关系鉴定的方法。
背景技术
[0002]亲子鉴定是根据人类遗传学的理论和实践，从子代和亲代的形态构造或 者生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，对可疑的父子关系或母子关系 进行判断，并作出肯定或者否定的结论。而判断亲子关系最早用于检测遗传 多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基因组中可变数目的串联重复 (VNTR)做限制性片段长度多态性分析。随着技术的进步，DNA聚合酶链式反 应(PCR)，使得较短的核酸片段也能用于分析，将分析目标集中到VNTR中的 较短的短串联重复序列(STR)，加上多重PCR技术的应用，迅速使STR基因座 的分型检测在法医和刑侦中应用起来。STR也成为目前最常用的遗传标记。
[0003]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是第三代遗传 学标记，这种遗传标记是由于单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基， 其中最少的一种在体中的频率不少于1％。与第一代的RFLP及第二代的STR 以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。SNP的分布密集，如果以1％的 频率计算，在人基因组中就有300万个以上的SNP遗传标记，这可能达到了 人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。 在医学遗传学、体遗传学和药物基因组学中有广泛的应用。在法医物证检 验中，也由于SNP的含量丰富、遗传稳定，而引起了高度重视。
[0004]产前亲子鉴定，也称胚胎期亲子鉴定、胎儿亲子鉴定，是指利用基因技 术鉴定胎儿生物学意义上的父亲。现有产前亲子鉴定技术是从胎儿绒毛或者 孕妇羊水中提取DNA物质，鉴定检测出胎儿的STR与疑似父亲的DNA进行比 对，以确认亲子关系。
[0005]现有技术建库方法和测序原理需要采集孕妇5ml的血液，血液的运输条件 和采集要求比较高。目前，针对血浆保存管保存温度是6-37度，在夏天或者 北方地区的冬天就需要采取控温措施，这样也加大了快递难度；同时，5ml血 液采集需要到有采血资格的采血点或者医院才能采集，给客户增加采血的难 度。
[0006]因此，如何改进产前亲权鉴定方法才能实现利用少量血浆进行测序，则 是本领域技术人员需要解决的重要技术问题之一。
发明内容
[0007]为解决上述问题，本发明提供一种产前亲权关系鉴定的方法的技术方案 其包括如下步骤：
[0008]步骤一，设计位点及引物；
[0009]步骤二，提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA；
[0010]步骤三，样品DNA的片段制备；
[0011]步骤四，样品DNA片段于测序前的处理；
[0012]步骤五，测序；
[0013]步骤六，测序数据后处理，并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点；[0014]步骤七，将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP位点进行对 比，最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点，最高碱基类型不同则将 该位点定义为一个否定位点，统计出肯定位点和否定位点的数目；
[0015]步骤八，根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
[0016]进一步优选的：所述的步骤三具体包括：环化样品DNA，消化环化到的环 化产物，扩增消化到的循环核酸，并打断扩增到的循环核酸。
[0017]进一步优选的：所述的步骤五中所述测序为高通量测序。
[0018]进一步优选的：所述的步骤四包括：扩增含有SNP位点的片段，纯化扩 增到的PCR 产物，并将PCR产物末端修复，筛选得到平末端DNA片段，接头 连接，得加接头的DNA片段，PCR扩增及纯化得到小片段文库，检测小片段 文库的文库浓度和片段大小。
[0019]进一步优选的：所述的步骤五中所述测序为Nanopore测序。
[0020]进一步优选的：所述的步骤五包括：
[0021]1)打开Nanopore测序仪启动口，检查阀盖下是否有小气泡；
[0022]2)步骤四所获得的样品DNA片段准备和加样SpotON flow cell：准备 priming mix：将RBF，Nuclease-free water混匀后，吸800ul注 入到priming port，室温静置5min；文库准备：RBF，LLB， Nuclease-free water，DNA library混匀后，吸取75ul滴入进样孔， 盖上盖子，准备测序；
[0023]3)根据MinKNOW指示运行程序，进行测序；
[0024]4)从nanopore测序仪上获得fastq测序结果的文件；
[0025]5)将上步每一条长序列得到的多条短序列采用多对齐算法，彼此对齐， 校准碱基。
[0026]进一步优选的：所述的步骤四包括：将样品DNA片段末端修复，筛选及 纯化得到粘性末端，接头连接，得加接头的DNA片段，将加接头的DNA片段 进行筛选及纯化得待测序DNA。
[0027]进一步优选的：所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血或孕妇白细胞样 本。[0028]进一步优选的：所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血时，需采 10ul-1.2ml血浆，再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离DNA。
[0029]与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0030]本发明所述的方法利用一种不同的DNA扩增方式：即环化扩增，该方法 降低了对血液样本量的需
求，另外采用环化扩增，在测序方式上选择更加多 样，可以选择二代测序和三代测序，测序方式的不同意味对时间和成本都能 有更多选择；
[0031]另，本发明中使用了三代测序nanopore，环化扩增游离DNA，解决了这 款三代测序仪在血浆游离DNA方面的应用的劣势，同时于实验，测序和数据 分析SNP分型步骤都有不同，本实施例实验时间快且对实验环境要求低，进 一步减少血液运输的要求；
[0032]综上所述，本发明解决了客户不方便采集样品的技术问题，实现少量采 集血浆同样达到亲权鉴定准确性及实际操作性的目的，解决了大部分客户的 需求，使得样品采集方法普及，提升了整个产前亲权关系鉴定的实用性及实 际可操作性。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议