(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.10.01
C N 104073555
A (21)申请号 201410203476.5
(22)申请日 2014.05.14
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人深圳市博锐德生物科技有限公司
地址518000 广东省深圳市宝安区福永街道
塘尾华丰科技园第10幢C 座第七层
(72)发明人程浩 陶思恩 邓少君 张翔
庄学敏 钟彩颜
(74)专利代理机构深圳市中知专利商标代理有
限公司 44101
代理人
张学
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种精子DNA 碎片检测试剂
盒，包括：包被载玻片，易熔凝胶，A 液，B 液，瑞氏 染液，瑞氏缓冲液，SCD 保存液。本发明还提供了
应用上述试剂盒对精子DNA 碎片的检测方法。本
发明根据检测方法优化了试剂结构，使得试剂稳
定、可靠，而且应用这些试剂进行检测时操作简单
且无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广；
本发明采用了独有的SCD 保存液，可以有效的保
存精液标本，其DNA 碎片率在-20℃冻存两个星期
内不发生变化，这样通过SCD 保存液可以轻松保
存所需的标本，不受时间和数量所限的进行检测，
节省了大量的人力物力。
(51)Int.Cl.
权利要求书3页 说明书11页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书3页 说明书11页 附图1页(10)申请公布号CN 104073555 A
1.一种精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，包括：
包被载玻片，
易熔凝胶，
A液，
B液，
瑞氏染液，
瑞氏缓冲液，
SCD保存液；
所述包被载玻片为包被有0.1～5％的熔点为20～60℃的琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.1～5％的熔点为20～60℃的琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.01％～0.5％氯化钠、0.1％～5％氨基乙
酸、0.1％～1％冰醋酸、0.01％～0.5％过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.1％～1％SDS、1％～10％Tris、0.1％～1％二水乙二胺四乙酸二钠、0.1％～1％吐温20且pH值为7.0～8.0的水溶液；所述瑞氏染液为含0.05～0.5％瑞氏素、0.01～0.1％吉氏素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.0～7.0的0.01～0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述SCD保存液为含0.1～1％氯化钠、40～80％吐温20的水溶液。
2.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述包被载玻片的制备方法为：
1)称取低熔点琼脂糖1～50g置于能装下1000ml的容器中，加入50～200ml纯化水，50±5℃水浴搅拌使琼脂糖完全溶解；
2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50±5℃水浴保温；
3)趁热将步骤2)溶液置于载玻片表面铺平，烤干。
3.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述易熔凝胶的制备方法为：
1)称取琼脂糖1～50g置烧杯，置于能装下1000ml的容器中，加入50～200ml纯化水，在水浴箱内50±5℃水浴搅拌使琼脂糖完全溶解；
2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50±5℃水浴保温2个小时；
3)趁热将步骤2)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
4.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述A液的制备方法为：
1)取50～200ml纯化水置于1000ml容量瓶中，称取氯化钠0.1～5g、氨基乙酸1～50g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
2)量取冰醋酸1～10ml、30％过氧化氢0.33～16.7ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
5.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述B液的制备方法为：
1)取50～200ml纯化水置于1000ml容量瓶中，称取SDS1～10g、Tris10～100g、二水乙二胺四乙酸二钠1～10g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
2)量取吐温201～10ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.0～8.0。
4)以纯化水定容至1000ml。
6.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述瑞氏染液的制备方法为：
1)称取0.25～2.5g瑞氏素、0.05～0.5g吉氏素，置洁净烧杯中，加入5～20ml 甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加5～20ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕试剂瓶保存。
7.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述瑞氏缓冲液的制备方法为：
1)取50～200ml纯化水置于1000ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠1.071～10.712g、磷酸二氢钾1.107～11.067g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
2)用pH计检测溶液pH值，6.0～7.0为合格，偏酸用浓十二水磷酸氢二钠调校，偏碱用磷酸二氢钾调校；
3)以纯化水定容至1000ml。
8.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述SCD保存液的制备方法为：
1)取50～200ml纯化水置于1000ml容量瓶中，称取氯化钠1～10g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
2)量取吐温20400～800ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
9.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述包被载玻片为包被有0.5％低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.25％琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.05％氯化钠、0.55％氨基乙酸、0.25％冰醋酸和0.045％过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.25％SDS、2.422％Tris、0.125％二水乙二胺四乙酸二钠、0.15％吐温20且pH值为7.2～7.4的水溶液；所述瑞氏染液为含0.1％瑞氏素、0.03％吉氏素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.2～6.4的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；所述SCD保存液为含0.36％氯化钠、45％吐温20的水溶液。
10.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1.试剂准备
1)将装有0.14ml易熔凝胶的样品管置于80℃孵育20分钟，待完全融化后，将易熔凝胶管置于37℃待用，至少平衡5分钟；
2)检测前将室温调整至20～28℃左右；
2.标本准备
1)以生理盐水调整液化的新鲜精子或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子浓度至5～10×106/ml；
2)不能完成检测的新鲜标本，使用SCD保存液后冷冻保存，方法如下：在Eppendorf管中加入SCD保存液300μl和待保存精液100μl，充分混匀，置于-20℃或-80℃保存，检测
时，将其室温平衡后，以生理盐水调整精子浓度至5～10×106/ml；
3.检测步骤
1)取已准备好的待测标本60μl，加入上述易熔凝胶已熔化的样品管中，充分混匀，得到悬液，37℃孵育待用；
2)将包被载玻片置于2～8℃冰箱预冷5分钟后取出，迅速于载玻片包被区域加入步骤1)制备的悬液30μl；
3)迅速盖上盖片，避免产生气泡；置2～8℃冰箱5分钟，使其凝固；
4)从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖片；
5)将载玻片立即垂直浸入盛有A液的反应池内，20～28℃反应7分钟；
6)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有B液的反应池内，2
0～28℃准确反应25分钟；
7)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片水平浸入大量的纯化水中5分钟，其间换水1～2次；
8)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有70％乙醇的反应池内，2分钟；
9)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有90％乙醇的反应池内，2分钟；
10)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有100％乙醇的反应池内，2分钟；
11)空气中自然干燥；
12)每张载玻片以瑞氏染液15～20滴覆盖，等1min后再缓慢地加入瑞氏缓冲液30～40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液，室温静置15min后以流水轻轻冲洗染片；
13)自然干燥或吹干；
14)40×显微镜下观察500个精子，计数存在DNA碎片的精子数量。
精子DNA碎片检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于体外检测试剂类，特别涉及精子DNA碎片检测试剂盒。
背景技术
[0002] 精子DNA的碎片程度反映了精子遗传物质的完整性。精子染质扩散法是检测精子DNA碎片的主要方法之一。DNA完整的精子在经过变性和去掉核蛋白后DNA扩散形成特征性的光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生这种特征性的光晕，根据光晕的有无和大小判断精子的DNA完整程度。
[0003] 目前，市面上已经有商家推出商业化的精子DNA碎片检测试剂盒，但大都存在一些问题，如：背景颜太深、精子尾部不清晰、光晕太小导致判读困难等问题。
发明内容
[0004] 本发明的主要目的在于提供一种方法学特异、结果易于判定、操作简单、易于临床推广应用的精子DNA碎片检测试剂盒。
[0005] 本发明提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括：
[0006] 包被载玻片，
[0007] 易熔凝胶，
[0008] A液，
[0009] B液，
[0010] 瑞氏染液，
[0011] 瑞氏缓冲液，
[0012] SCD保存液；
[0013] 所述包被载玻片为包被有0.1～5％的熔点为20～60℃的琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.1～5％的熔点为20～60℃的琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.01％～0.5％氯化钠、0.1％～5％氨基乙酸、0.1％～1％冰醋酸、0.01％～0.5％过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.1％～1％SDS、1％～10％Tris、0.1％～1％二水乙二胺四乙酸二钠、0.1％～1％吐温20且pH值为7.0～8.0的水溶液；所述瑞
氏染液为含0.05～0.5％瑞氏素、0.01～0.1％吉氏素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.0～7.0的0.01～0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述SCD保存液为含0.1～1％氯化钠、40～80％吐温20的水溶液。
[0014] 所述包被载玻片的制备方法为：
[0015] 1)称取低熔点琼脂糖1～50g置于能装下1000ml的容器中，加入50～200ml纯化水，50±5℃水浴搅拌使琼脂糖完全溶解；
[0016] 2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50±5℃水浴保温；
[0017] 3)趁热将步骤2)溶液置于载玻片表面铺平，烤干。
[0018] 所述易熔凝胶的制备方法为：
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