(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810985901.9
(22)申请日 2018.08.28
(71)申请人 天津科技大学
地址 300457 天津市滨海新区经济技术开
发区第13大街9号
(72)发明人 刘浩 徐永学
(74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限
公司 12209
代理人 赵瑶瑶
(51)Int.Cl.
C12N 1/15(2006.01)
C12N 15/80(2006.01)
C12N 15/90(2006.01)
C12N 15/52(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
C12N 15/55(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12P 7/46(2006.01)C12R 1/685(2006.01) (54)发明名称
及其构建与应用
(57)摘要
本发明提供一种高产L -苹果酸的黑曲霉
(Aspergillus niger)基因工程菌株。本发明还
提供一种上述基因工程菌株的构建方法。该方法
利用基因敲除技术破坏黑曲霉草酰乙酸水解酶
基因(oahA)从而获得了苹果酸高产菌株S2。经过
7天摇瓶发酵，
可将100g/L的葡萄糖转化成120.4±2.8g/L L -苹果酸，苹果酸对葡萄糖的转化率
达到1.62mol/mol，达到理论最高转化率的81％。
为苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株。权利要求书3页 说明书9页序列表4页 附图5页CN 109207383 A 2019.01.15
C N 109207383
A
1.一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉基因工程菌株是过表达黑曲霉来源的丙酮酸羧化酶基因pyc和黑曲霉来源的苹果酸脱氢酶基因mdh、异源表达米曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白C4T318基因并敲除了草酰乙酸水解酶基因oahA的黑曲霉基因工程菌株。 2.根据权利要求1所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述乙酸水解酶基因基因为NCBI-locus_tag为An10g00820的基因，基因序列为序列表中的SEQ NO.7。
3.构建权利要求1所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的方法，其特征在于：
步骤如下：
(1)构建表达pyc基因质粒
以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因pyc序列片段；将所述基因pyc序列片段克隆到载体pLH331，构建基因pyc表达质粒pLH395；
(2)pyc基因过表达菌株的获得
将所述质粒pLH395转化至宿主菌株S469，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因过表达菌株；
(3)构建表达mdh基因质粒
以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因mdh序列片段；将所述基因mdh序列片段克隆到载体pLH331，构建基因mdh表达质粒pLH373；
(4)pyc基因和mdh基因共过表达菌株的获得
将所述质粒pLH373转化至pyc基因过表达菌株S453，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因和mdh基因共过表达菌株；
(5)构建表达C4T318基因质粒
以野生型米曲霉NRRL 3488基因组为模板，通过PCR反应扩增获得基因C4T318序列片段；将所述基因C4T318序列片段克隆到载体pLH454，构建基因C4T318表达质粒pLH455；
所述基因C4T318由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA 序列为序列表中的SEQ NO.4，长度为932bp；
(6)pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株的获得
将所述质粒pLH455转化至pyc和mdh基因共过表达菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株；
(7)构建基因oahA敲除质粒：
以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增获得基因oahA的上游和下游序列片段；将所述基因oahA的上下游序列片段克隆到载体pLH314，构建基因oahA敲除质粒pLH398；
(8)pyc和mdh基因共过表达、异源表达C4T318基因且oahA基因敲除菌株的获得
将所述质粒pLH398转化至pyc和mdh基因共过表达且异源表达C4T318基因菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pyc基因和mdh基因共过表达、异源表达C4T318基因且oahA基因敲除菌株。
4.权利要求1所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的发酵方法，其特征在于：将工程菌株接种在PDA培养平板上在28℃培养6天直至产生分生孢子，将孢子悬液接种于摇瓶
发酵培养基中，孢子的终浓度为2×106孢子/ml，在28℃，220rpm培养7天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：100g/L glucose,80g/L CaCO3,6g/L Bacto Peptone,150mg/L KH2PO4,150mg/L K2HPO4,100mg/L MgSO·7H2O,100mg/L CaCl2·2H2O,5mg/L FeSO4·7H2O,5mg/LNaCl。
6.构建权利要求3所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的方法，其特征在于：
步骤如下：所述宿主菌株S469的构建方法如下：
(1)含有loxP-hph-loxP元件质粒的构建
loxP-hph-loxP元件序列由北京华大基因合成，然后经酶切连接克隆到载体pFGL59Ble 构建质粒pLH314；pLH314经XhoI单酶切后连接得到质粒pLH331(loxP-hph-loxP)；pLH314用于构建敲除质粒的出发载体；以黑曲霉ATCC1015基因组为模板，p635/p636和p637/p638为引物分别扩增pyrG基因两端的DNA序列，然后分别克隆到载体pLH314构建pyrG敲除质粒pLH323；
(2)含有Tet-on-cre元件质粒的构建
以黑曲霉ATCC1015基因组为模板，p603/p604为引物经PCR扩增pyrG及其自身启动子和终止子，克隆到载体pFGL59得到质粒pLH310(pyrG)；cre经密码子优化后，Tet-on-cre序列由北京华大基因合成，然后克隆到载体pLH310(pyrG)分别得到Tet-on调控Cre表达的质粒pLH409；pyrG扩增产物经测序验证未有突变；
(3)Cre-loxP遗传操作系统的构建
为了将cre表达元件成功整合到黑曲霉基因组且不残留外源的抗性标记基因，因此选用pyrG为筛选标记进行转化；以pyrG为筛选标记进行转化的前提是出发菌株为pyrG缺陷菌株，即尿嘧啶营养缺陷菌株ΔpyrG；因此首先通过农杆菌介导转化的方法将pLH323转化到黑曲霉野生菌株ATCC1015中，经双交换同源重组得到pyrG敲除菌株ΔpyrG S296；在同源臂以外的序列上设计引物p639/p640，提取S296基因组为模板，经PCR验证pyrG基因被敲除；
由于pyrG部分序列被loxP-hph-loxP取代，得到的转化子具有尿嘧啶营养缺陷和潮霉素抗性的特点，因此S296必须在补充有尿嘧啶的培养基中培养；
以ΔpyrG S296为出发菌株，通过农杆菌介导转化质粒pLH409，将由Tet-on调控表达的cre基因整合到S296基因组得到菌株S462；由于pLH409转化过程是以pyrG为筛选标记，所以得到的阳性转化子中pyrG基因得以回补成为尿嘧啶原养型，即出发菌株的尿嘧啶营养缺陷表型得以恢复；提取S462基因组，以p1109/p604为引物，经PCR验证Tet-on-cre元件是否整合到基因组；
S462菌株中Tet-on-cre元件的成功整合，使得S462菌株在含有强力霉素的培养基中能够诱导表达Cre重组酶，Cre重组酶可以识别loxP位点，从而将loxP-hph-loxP中的hph marker重组掉，实现hph marker的反复使用，进而连续应用同一个hph marker实现多个基因的过表达或敲除；
为了重组去除S462菌株中的hph marker，将黑曲霉S462的孢子约300个，均匀涂布在含有10μg/mL强力
霉素的MM培养基中进行诱导培养至长出单克隆，挑取100个单克隆同时接种于PDA和含有250μg/mL潮霉素的PDA培养基中，在含有250μg/mL潮霉素的PDA培养基中筛选潮霉素敏感克隆，用p607/p608引物PCR验证hph marker的去除，选择其中一个正确的克隆，命名为S469；该S469菌株即为构建高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的宿主菌。
7.构建权利要求3所述的高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的方法，其特征在于：所述S469菌株是在基因组内整合了外源cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达。当以所述菌株S469为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，可通过强力霉素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达或敲除且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留。
一种高产L -苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及其构建与应用
技术领域
[0001]本发明属于生物工程领域，更具体地说涉及一种高产L -苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建及应用。
背景技术
[0002]L -苹果酸，又名2-羟基丁二酸，主要用于食品、医药等行业。在食品行业，由于L -苹果酸味道柔和、酸度大，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L -苹果酸被用于肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L -苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。此外，L -苹果酸在日化保健业等行业也有广泛的应用前景。因此，国际市场上对L -苹果酸的需求量与日俱增。
[0003]当前，化学合成法和固定化酶技术是工业上生产苹果酸的主要方法。其中，化学合成法生产的苹果酸为消旋型DL -苹果酸，而一些国家规定饮料和药品中不能使用DL -苹果酸，限制了消旋型苹果酸的应用范围。固定化酶技术虽然可以光学纯度的L -苹果酸，但是其底物富马酸来源于石油基化学品马来酸。因此，具有较好经济、环境和社会效益的发酵法生产L -苹果酸成为研究的热点。然而，目前发酵法生产苹果酸存在的问题仍是缺乏优良的生产菌株。利用黄曲霉菌株发酵合成L -苹果酸，虽然能够获得113g/L的产量，但是由于产生黄曲霉毒素和高浓度杂酸，限制了其工业应用。近年来应用基因工程策略，对大肠杆菌、酵母菌等微生物代谢途径进行改造获得基因工程菌株取得较大进展，但是由于产量不够高或者有大量副产物杂酸的存在等瓶颈，阻碍了其工业化发酵生产苹果酸的进程。
[0004]黑曲霉的优势：黑曲霉作为重要的细胞工厂用于柠檬酸发酵生产已有100多年的历史，具有非常强的耐酸性，在pH低于2的条件下能够正常生长，不仅是GRAS(generally regarded safe)菌株，而且能够
利用廉价的碳源。然而由于野生型黑曲霉菌株较低的苹果酸产量，鲜有研究报道通过代谢工程策略，改造黑曲霉菌种用于苹果酸的发酵生产。发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种高产L -苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。
[0006]一种高产L -苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是过表达黑曲霉来源的丙酮酸羧化酶基因pyc和黑曲霉来源的苹果酸脱氢酶基因mdh、异源表达米曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白C4T318基因并敲除了草酰乙酸水解酶基因oahA的黑曲霉基因工程菌株。
[0007]本发明所用的宿主菌株是本实验室构建的能够表达Cre重组酶的黑曲霉菌株S469。所述S469菌株是在基因组内整合了外源cre基因，该基因受Tet -on系统的调控表达。当以所述菌株S469为出发菌进行遗传改造，并以loxP -hph -loxP为筛选标记时，可通过强力霉素启动Tet -on系统表达Cre重组酶，实现对loxP -hph -loxP元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达或敲除且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗
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