(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910880078.X
(22)申请日 2019.09.18
(71)申请人 清华大学
地址 100084 北京市海淀区清华大学
(72)发明人 于慧敏 梁有向 焦松 唐玲珺
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 陈波
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12P 13/02(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了基因工程技术领域的一种基
因工程红球菌及其构建方法与应用。其中的基因
工程红球菌构建的方法，是基于CRISPR/Cas9的
基因编辑方法，基因敲除效率高，能实现无痕敲
除，以及基因叠加敲除，为红球菌的基因改造提
供了高效的操作工具。以酰胺酶基因敲除为例，
其敲除效率可达到75％。同时，利用上述编辑方
法构建的低副产物合成、高催化稳定性红球菌，
应用于催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺或丙烯酸
铵制备中，催化稳定性好，效率高，具有良好的应
用前景。
权利要求书1页 说明书10页序列表8页 附图6页CN 110499274 A 2019.11.26
C N 110499274
A
1.一种基因工程红球菌构建的方法，其特征在于，包括在宿主中过表达重组酶基因，并利用同源重组的方法敲除、插入或突变目的基因，构建基因工程菌。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组酶基因过表达的方法为在宿主中通过载体转入重组酶基因和/或所述重组酶基因处于强启动子控制之下。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述同源重组的方法包括利用CRISPR/Cas9系统进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述同源重组的方法包括将含有Cas9基因的载体、目标基因上下游同源臂和含有相应sgRNA表达盒的载体转入宿主。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含相应sgRNA表达盒的载体为温敏型质粒，在特定温度下可快速丢失，进行多轮叠加基因编辑。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述Cas9基因如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述重组酶基因为分枝杆菌噬菌体的重组酶基因，优选的，所述重组酶基因为Che9c60&61。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述红球菌为R.ruber TH。
9.一种基因工程红球菌构建的方法，其特征在于，包括在红球菌中过表达重组酶基因，并利用同源重组的方法敲除酰胺酶基因，并将突变腈水合酶基因或腈水解酶基因原位替换野生型腈水合酶基因，构建基因工程菌。
10.权利要求1-9任一项所述的方法构建的基因工程红球菌。
11.权利要求10所述的基因工程红球菌在丙烯酰胺或丙烯酸铵制备中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 110499274 A
一种基因工程红球菌及其构建方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程红球菌及其构建方法与应用。
背景技术
[0002]红球菌是一种革兰氏阳性放线菌，具有丰富的代谢酶系、良好的有机溶剂耐受性，因此广泛应用于生物催化、生物修复和生物合成等方面。譬如，红(赤)红球菌和紫红红球菌游离细胞可高表达腈水
合酶，对极性溶剂丙烯腈和丙烯酰胺具有良好的耐受性，已成功用于丙烯酰胺、烟酰胺等化学品的生产(CN101892228A；CN104762338A)；红平红球菌具有脱硫酶系，可应用于生物脱硫，在环保领域具有重要作用(CN107557106A)；浑浊红球菌可降解、利用木质素生产油脂，其对芳香类化合物有丰富的代谢酶系，对木质素降解产物如有机酸、呋喃类、芳香类和卤代化合物有良好的耐受性，因此被视为木质纤维素资源利用的理想平台(DeLorenzo,et al.,ACS Synth Biol 2018,7(2),727-738.)。然而，红球菌的基因改造工具仍然比较匮乏，限制了红球菌的工程化改造。
[0003]微生物法生产丙烯酰胺工艺最早由日本日东公司于1985年开发，其利用微生物如红球菌高表达腈水合酶，催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。该工艺具有选择性、收率高等特点，发展至今已有30多年的历史，并广泛实现产业化。尽管比化学法有明显优势，微生物法仍然存在一些问题，包括水合过程中副产物丙烯酸的生成(Ma,et al.,Bioresource Technol 2010,101(1),285-291.)、细胞催化稳定性仍需提高(Chen,et al.,Journal of Biotechnology 164(2012)354–362)等。红球菌细胞的腈类代谢酶系包括腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶，酰胺酶可将目标产物丙烯酰胺进一步反应生成丙烯酸，腈水解酶可将底物丙烯腈一步转化成丙烯酸，因此降低了丙烯酰胺的收率和纯度，从而增加生产成本。利用无腈类代谢酶系的宿主如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌克隆表达腈水合酶，是避免副产物生成的有效方法，但存在酶活低、催化稳定性差等问题(CN1584024；Kang,et al.,Appl Microbiol Biot 2014,98(10),4379-4387.)，因此丙烯酰胺的微生物法生产中红球菌仍是主流生物催化剂。对红球菌的酰胺酶、腈水解酶进行基因敲除是产生
副产物问题的重要解决方法。针对催化稳定性的问题，于慧敏等构建了高稳定性的腈水合酶突变体，在红球菌中使用质粒过表达该突变体，可以实现多批次约50％丙烯酰胺的水合生产(CN107177581A)，但突变体的表达受质粒稳定性、基因组天然高表达野生型腈水合酶的影响，表达量有限，若将该突变体原位替换野生型腈水合酶，稳定性将进一步提高。上述问题及应对策略，对红球菌的基因编辑方法提出了要求。
[0004]目前红球菌的基因组改造缺乏高效的编辑方法，主要依赖于借助自杀质粒的同源重组单交换和双交换。红球菌存在比较严重的非法重组现象(Desomer,et al.,Molecular Microbiology 1991,5(9),2115-2124.)，自杀质粒转化红球菌时可随机插入到基因组的各个位置而非特异性到目标基因处，因此导致敲除效率极低。CRISPR/Cas9(the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats /CRISPR-associated nuclease
9)是近几年发展起来的强大的基因编辑工具，已广泛应用于很多种动物、植物、微生物的基因组改造。Cas9是一种核酸酶，可与向导RNA(sgRNA)结合并在sgRNA的引导下在目标基因位置引入DNA双链断裂，通过非同源性末端接合(NHEJ)或者同源重组修复(HDR)，可实现目标基因的失活(Ran,et al.,Nature Protocols 2013,8(11),2281-2308.)。红球菌基因操作困难、同源重组效率低，增加了CRISPR/Cas9在红球菌中应用开发的难度，目前CRISPR/Cas9基因敲除在红球菌中的应用仍未见报道。
发明内容
[0005]为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种基因工程红球菌构建的方法，包括在宿主中过表达重组酶基因，并利用同源重组的方法敲除、插入或突变目的基因，构建基因工程菌。
[0006]上述方法中，所述重组酶基因过表达的方法为在宿主中通过载体转入重组酶基因和/或所述重组酶基因处于强启动子控制之下。
[0007]上述方法中，所述同源重组的方法包括利用CRISPR/Cas9系统进行。
[0008]上述方法中，所述同源重组的方法包括将含有Cas9基因的载体、目标基因上下游同源臂和含有相应sgRNA表达盒的载体转入宿主。
[0009]上述方法中，所述含相应sgRNA表达盒的载体为温敏型质粒，在特定温度下可快速丢失，进行多轮叠加基因编辑。
[0010]上述方法中，可选的，所述含有Cas9基因的载体为pNV18，优选pNV18-Pa2。[0011]上述方法中，所述目标基因上下游同源臂分别为500-1500bp，优选500-1000bp。[0012]上述方法中，所述Cas9基因如SEQ ID NO.1所示。
[0013]上述方法中，所述重组酶基因为分枝杆菌噬菌体的重组酶基因，优选的，所述重组酶基因为Che9c60&61(DeLorenzo,et al.,ACS Synth Biol 2018,7(2),727-738.)。[0014]上述方法中，可选的，所
述重组酶基因的表达载体为pRCTc，优选pRCTc-Pa2。[0015]上述方法中，优选的，所述红球菌为R.ruber TH(Ma,et al.,Bioresource Technol 2010,101(1),285-291.)。
[0016]进一步的，本发明还提供了一种基因工程红球菌构建的方法，包括在红球菌中过表达重组酶基因，并利用同源重组的方法敲除酰胺酶基因，并将突变腈水合酶基因或腈水解酶基因原位替换野生型腈水合酶基因，构建基因工程菌。
[0017]上述方法中，可选的，所述突变腈水合酶基因为中国专利文献CN107177581A中所述的腈水合酶突变体。
[0018]例如，上述方法中，具体可以包括，所述Cas9基因如SEQ ID NO:1所示，将Cas9基因连接到穿梭质粒pNV18.1(Chiba,et al.,Jpn J Infect Dis 2007,60(1),45-47.)，启动子为Pa2。将过表达适用于红球菌宿主的Cas9基因的载体pNV18-Pa2-Cas9转化到含有重组酶的红球菌R.ruber TH(Che9c60&61)，得到同时表达重组酶和Cas9的基因工程红球菌R.ruber TH(Cas9+Che9c60&61)；然后将拟敲除的目标基因上下游同源臂和含相应sgRNA表达盒的载体同时转化红球菌R.ruber TH(Cas9+Che9c60&61)，得到实现基因编辑的基因工程红球菌。
[0019]可选的，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0020]可选的，进一步，将sgRNA表达盒序列连接到穿梭质粒pBNVCm上，启动子为不带有核糖体结合位点(RBS)的强组成型启动子PamiC(Jiao et al.,New Biotechnol 2018,44: 41-49.)。所述穿梭质粒pBNVCm是以pNV18.1为骨架，替换复制子，替换抗性基因而得。所述的拟敲除目标基因上下游同源臂序列，通过PCR扩增得到，以红球菌R.ruber TH为模板，分别扩增目标基因上游、下游同源序列，通过overlap PCR将两段序列融合得到同源臂。[0021]进一步的，本发明还建立了利用CRISPR/Cas9进行多轮叠加基因编辑的方法构建基因工程菌。本发明中利用CRISPR/Cas9实现基因敲除的红球菌同时含有3个质粒，其中携带sgRNA的穿梭质粒pBNVCm为温敏型，37℃培养条件下可快速丢失，从而可引入靶向新的拟敲除基因的sgRNA质粒进行下一轮基因编辑。
[0022]将同时携带三个质粒的红球菌接种到含四环素和卡那霉素的种子培养基中，37℃培养72小时，菌液稀释涂布于含四环素和卡那霉素的平板，37℃培养72小时，生长的菌落划线于含氯霉素的平板，若不生长说明已经丢失sgRNA质粒。丢失了sgRNA质粒的红球菌含有分别携带Cas9、重组酶的两个质粒，制备成感受态细胞，共转化新sgRNA质粒和拟敲除基因的同源臂，进行下一轮基因编辑。最后得到的菌株在不含抗生素的条件下培养，可同时丢失3个质粒，得到工业菌株进行性能评价。
[0023]本发明还提供了上述任一方法构建的基因工程红球菌。
[0024]同时，本发明还提供了上述基因工程红球菌在丙烯酰胺或丙烯酸铵制备中的应用。
[0025]具体的，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑方法构建了一种低副产物合成、高催化稳定性红球菌，应用于丙烯酰胺的高效生产。其要点是无痕敲除红球菌中副产物相关的酰胺酶基因(CN101663389)，得到重组红球菌R.ruber TH3-1，进一步将高稳定性的腈水合酶突变体(CN107177581A)替换基因组上的野生腈水合酶，得到的重组红球菌R.ruber TH8-2。所述重组红球菌TH8-2具有低副产物合成、高催化稳定性的特点，可用于生产高浓度丙烯酰胺，并实现多批次细胞回用
[0026]另外，本发明进一步拓展CRISPR/Cas9的应用，提供了一种红球菌基因组高效表达外源酶(如腈水解酶)的方法。使用上述CRISPR/Cas9基因编辑方法，将腈水解酶基因(CN105420154A)替换基因组上的腈水合酶基因，利用原腈水合酶的启动子高效表达腈水解酶，且避免了质粒不稳定问题。
[0027]本发明的有益效果：
[0028]本发明建立了基于CRISPR/Cas9的红球菌基因编辑方法，基因敲除效率高，能实现无痕敲除，以及基因叠加敲除，为红球菌的基因改造提供了高效的操作工具。以酰胺酶基因敲除为例，其敲除效率可达到75％。进一步，本发明利用CRISPR/Cas9编辑方法构建的低副产物合成、高催化稳定性红球菌R.ruber TH8-2，应用于催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺，催化副产物的酰胺酶活性降低60％，催化稳定性提高1.2倍，在高浓度丙烯酰胺生产过程中，产物浓度达到500g/L，可实现4批次细胞回用，副产物丙烯酸浓度降低80％，具有良好的应用前景。再进一步地，本发明提出的利用红球菌基因组表达外源酶的
策略，借助于原腈水合酶的强启动子，基因组表达腈水解酶，其酶活相比于质粒表达提高了51％，且避免了质粒稳定性的问题。
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