(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111646816.8
(22)申请日 2021.12.29
(71)申请人 南京维特康检测技术有限公司
地址 210000 江苏省南京市浦口区行知路8
号南京国家农创园科创中心1085号
(72)发明人 康乐 曲向阳
(74)专利代理机构 南京中律知识产权代理事务
所(普通合伙) 32341
代理人 祝坤
(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种可有效提升病毒核酸回
收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，包括尿素、
硫脲、硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、胆酰胺丙基、氨
基丁三醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯
基醚、苯、氯化钠、氟化钠、盐酸胍、异
抑制剂、磷酸酶抑制剂、原矾酸钠，主要利用盐酸
入蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸
的羧基端肽键，通过加入蛋白酶抑制剂能够有效
的抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，通过加入磷酸酶
抑制剂，能够抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，
能够有效的提升病毒核酸回收效率，提高了工作
效率，
方便实用。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 114214317 A 2022.03.22
C N 114214317
A
1.一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，包括以下原料：尿素、硫脲、硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、胆酰胺丙基、氨基丁三醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚、苯、氯化钠、氟化钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、蛋白酶K、脱氧胆酸钠、蒸馏水、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、原矾酸钠，并按照以下组成进行配比：尿素4.2g、硫脲1.5g、硫苏糖醇0.2g、乙二胺四乙酸0.7ml、胆酰胺丙基0.3g、氨基丁三醇5ml、乙基苯基聚乙二醇0.5ml、聚乙二醇辛基苯基醚0.1ml、苯0.05g、氯化钠0.7g、氟化钠35mg、盐酸胍2g、异硫氰酸胍1g、蛋白酶K0.5ml、脱氧胆酸钠0.5g、蒸馏水5ml、蛋白酶抑制剂2ml、磷酸酶抑制剂1.5ml。
2.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述尿素、硫脲、硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、胆酰胺丙基、氨基丁三醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚、苯、氯化钠、氟化钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、蛋白酶K、脱氧胆酸钠按照组分配比导入试管内，通过在室内常温下利用振荡搅拌进行混合，在混合后37℃‑40℃水浴中2.5hr使其充分混合，得到混合溶液，将蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂依次加入混合溶液内，在室内常温下振荡搅拌进行混合，置于‑20℃避光保存。
3.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述盐酸胍在浓度为4‑8mol时可断裂氢键，通过加入尿素，对氨基酸具有增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，同时盐酸胍可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来，高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制Rnase活性。
4.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，二硫苏糖醇能够破坏RNase蛋白质中的二硫键，使Rna酶变性，同时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联。
5.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，同时能够降解天然蛋白质的能力，蛋白酶K的pH范围控制在pH 4‑12.5之间，同时将蛋白酶K的浓度控制在50‑100ug/ml，使其保持活性状态。
6.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂的组成成分为抑肽素A、亮抑霉肽、胰凝乳蛋白酶，并按照以下组分进行配比：抑肽素A1ml、亮抑霉肽1ml、胰凝乳蛋白酶0.5ml，抑肽素A能够有效的抑制各种天门冬氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV 蛋白酶，亮抑霉肽能够有效的抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶、半胱氨酸蛋白酶。
7.如权利要求6所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述磷酸酶抑制剂的组成成分为正钒酸钠、焦磷酸钠、原矾酸钠制成，正钒酸钠能够抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，焦磷酸钠能够抑制丝氨酸‑苏氨酸磷酸酶，原矾酸钠能够有效的抑制去磷酸化。
8.如权利要求1所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述原矾酸钠是将0.2g的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中，加酸调节ph值
为10，至颜变黄，通过加热煮至无状态时，在室内常温下静置冷却，再加酸调节ph值为10，重复加热煮至无，并且使ph值稳定于10，导入试管置于‑20℃避光保存。
9.如权利要求8所述的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其特征在于，所述乙基苯基聚乙二醇能够进行非离子性去垢，脱氧胆酸钠能够进行离子性去垢，能够有效的裂解细胞，溶解蛋白，同时能够有效的溶解难溶于水的膜蛋白。
一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂
配方
技术领域
[0001]本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方。
背景技术
[0002]磁珠法核酸提取，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在能够实现自动化、大批量操作，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对，磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程，从而实现核酸的自动化提取，广泛应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生
物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域，磁珠法核酸提取一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主要步骤，每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现，为了提升病毒核酸回收效率，其中裂解环节的核酸提取试剂是决定核酸提取之质量的重中之重，而现有技术的核酸提取试剂的提取效果较为一般，使得病毒核酸回收效率降低，提高了核酸提取工作时长，降低了工作效率，因此需要使用到可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方以便满足使用需求。
发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其主要利用盐酸胍加入尿素能够对氨基酸具有增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，同时盐酸胍可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来，高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制Rnase活性，通过加入蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，同时能够降解天然蛋白质的能力，通过加入蛋白酶抑制剂能够有效的抑制各种天门冬氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV 蛋白酶，同时也抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶、半胱氨酸蛋白酶，通过加入磷酸酶抑制剂，能够抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，同时抑制丝氨酸‑苏氨酸磷酸酶与抑制去磷酸化，能够有效的提升病毒核酸回收效率，减少工作时长，提高了工作效率，方便实用，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0005]一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，包括以下原料：尿素、硫脲、硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、胆酰胺丙基、氨基丁三醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚、苯、氯化钠、氟化钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、蛋白酶K、脱氧胆酸钠、蒸馏水、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、原矾酸钠，并按照以下组成进行配比：尿素4.2g、硫
脲1.5g、硫苏糖醇0.2g、乙二胺四乙酸0.7ml、胆酰胺丙基0.3g、氨基丁三醇5ml、乙基苯基聚乙二醇0.5ml、聚乙二醇辛基苯基醚0.1ml、苯0.05g、氯化钠0.7g、氟化钠35mg、盐酸胍2g、异硫氰酸胍1g、蛋白酶K0.5ml、脱氧胆酸钠0.5g、蒸馏水5ml、蛋白酶抑制剂2ml、磷酸酶抑制剂1.5ml。
[0006]优选的，所述尿素、硫脲、硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、胆酰胺丙基、氨基丁三醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚、苯、氯化钠、氟化钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、蛋白酶K、脱氧胆酸钠按照组分配比导入试管内，通过在室内常温下利用振荡搅拌进行混合，在混合后37℃‑40℃水浴中2.5hr使其充分混合，得到混合溶液，将蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂依次加入混合溶液内，在室内常温下振荡搅拌进行混合，置于‑20℃避光保存。[0007]优选的，所述盐酸胍在浓度为4‑8mol时可断裂氢键，通过加入尿素，对氨基酸具有增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，同时盐酸胍可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来，高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制Rnase活性。
[0008]优选的，所述异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，二硫苏糖醇能够破坏RNase蛋白质中的二硫键，使Rna酶变性，同时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联。[0009]优选的，所述蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，同时能够降解天然蛋白质的能力，蛋白酶K的pH范围控制在pH 4‑12.5之间，同时将蛋白酶K的浓度控制在50‑100ug/ml，使其保持活性状态。
[0010]优选的，所述蛋白酶抑制剂的组成成分为抑肽素A、亮抑霉肽、胰凝乳蛋白酶，并按照以下组分进行配比：抑肽素A1ml、亮抑霉肽1ml、胰凝乳蛋白酶0.5ml，抑肽素A能够有效的抑制各种天门冬氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV 蛋白酶，亮抑霉肽能够有效的抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶、半胱氨酸蛋白酶。
[0011]优选的，所述磷酸酶抑制剂的组成成分为正钒酸钠、焦磷酸钠、原矾酸钠制成，正钒酸钠能够抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，焦磷酸钠能够抑制丝氨酸‑苏氨酸磷酸酶，原矾酸钠能够有效的抑制去磷酸化。
[0012]优选的，所述原矾酸钠是将0.2g的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中，加酸调节ph 值为10，至颜变黄，通过加热煮至无状态时，在室内常温下静置冷却，再加酸调节ph值为10，重复加热煮至无，并且使ph值稳定于10，导入试管置于‑20℃避光保存。
[0013]优选的，所述乙基苯基聚乙二醇能够进行非离子性去垢，脱氧胆酸钠能够进行离子性去垢，能够有效的裂解细胞，溶解蛋白，同时能够有效的溶解难溶于水的膜蛋白。[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0015]本发明提出的一种可有效提升病毒核酸回收效率的磁珠法核酸提取试剂配方，其主要利用盐酸胍加入尿素能够对氨基酸具有增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，同时盐酸胍可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来，高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制Rnase活性，通过加入蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，同时能够降解天然蛋白质的能力，通过加入蛋白酶抑制剂能够有效的抑制各种天门
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