(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410187359.4
(22)申请日 2014.05.05
G01N 33/74(2006.01)
G01N 33/533(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(71)申请人江苏泽成生物技术有限公司
地址214000 江苏省无锡市江阴市澄江中路
159号D405
(72)发明人杨旻 汪丹 夏振伟
(74)专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理
事务所(普通合伙) 11411
代理人
曾少丽
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种促卵泡生成素(FSH)定量
测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试
剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明还公开了该
试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测促卵泡生
成素(FSH)的方法。本发明以异硫氰酸荧光素标
记的包被抗体和碱性磷酸酶标记的标记抗体制备
抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠
制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，
而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物
APLS 为底物，提高了试剂盒的灵敏度和特异性性
能。本发明的试剂盒性能可靠、检测灵敏度高，特
异性能好、线性范围宽，试剂盒稳定性好，有效期
可至一年以上。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书8页 附图1页CN 105092862 A 2015.11.25
C N 105092862
A
1.一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述试剂盒中各组分按照如下方法制备：
一、校准品、质控品的配制：
采用校准品缓冲液溶解促卵泡生成素(FSH)，配置校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备； 二、抗试剂的配制：
(1)、抗试剂缓冲液的制备：
Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；
(2)、将异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体和碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体加入到所述抗试剂缓冲液中充分搅拌至完全溶解；
三、磁微粒试剂的制备：
将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂；
四、发光底物的制备：
将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制得发光底物。
2.根据权利要求1所述的促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，其特征在于，所述抗试剂的制备方法如下：
(1)、异硫氰酸荧光素与促卵泡生成素(FSH)的偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体：
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，按照促卵泡生成素(FSH)与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1的量，将二者转移到棕玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时；充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液，进行平衡，然后凝胶层析分离纯化出异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)抗体包被抗体；
(2)、碱性磷酸酶与促卵泡生成素(FSH)的偶联，获得碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体：
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液；按照碱性磷酸酶与促卵泡生成素(FSH)抗体的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化出碱性磷酸酶标记的FSH标记抗体；
(3)、将步骤(1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体和步骤(2)中获得的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体，加入到含有表面活性剂的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、Triton X-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。
3.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：
(1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2～5倍于反应瓶中羧基磁珠
体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20-30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清；重复清洗羧基磁
珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；所述磁微粒缓冲液的配置方法是：Tris：12.12mg，氯化钠5.82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；
(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的质量比为100:1的比例，在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，2～8℃下保持混匀状态反应18小时；
(3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需的磁微粒试剂。
4.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，其特征在于，所述发光底物是按照以下步骤制备的：
用4～10倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS；所述发光底物缓冲液的配置方法是：Tris12.12g～121.14g，氯化钠5.82g，光泽精0.3g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5。
5.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法为：Tris12.12g，氯化钠5.82g，Tween-2050mL，曲拉通-100，50mL，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。
6.权利要求1-4任一项所述的一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒的制备方法，该方法包括：分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、促质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到促卵泡生成素(FSH)的定量测定试剂盒。
7.利用权利要求1～6任一项所述的一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒定量检测促卵泡生成素(FSH)的方法，该方法包括以下步骤：
(1)取三支试管分别加15μL校准品、15μL质控品、15μL待测样本；
(2)每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴15分钟；
(3)每一试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴5分钟；
(4)将试管在磁分离器上沉淀2分钟，缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液；把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(6)重复步骤(5)一次；
(7)每一试管中加入200μL发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。
促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒及其制备方法与检测
方法
技术领域
[0001] 本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测促卵泡生成素(FSH)的方法。
背景技术
[0002] 促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素，该激素是垂体分泌的促性腺激素之一。促卵泡生成素(FSH)的主要作用是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能。促卵泡生成素(FSH)可以促进女性卵泡生成、成熟，促进颗粒细胞增殖、起卵泡分泌；可以刺激男性睾丸支持细胞发育，并可作用于睾丸曲细精管可促进精子形成。正常人血清中FSH基础值为5～10IU/L。
[0003] 女性体内的促卵泡生成素(FSH)分泌具有明显的周期性，血液中促卵泡生成素(FSH)的浓度及每日由尿液排泄的促卵泡生成素(FSH)的量随月经周期变化而变化。在绝经或卵巢切除后，以及早熟卵巢的衰退期，血液和尿液中促卵泡生成素(FSH)排出量增加。[0004] 促卵泡生成素(FSH)在男性体内能够调控生精小管的发育以及保持生精作用，男性体内的促卵泡生成素(FSH)分泌无明显周期性，但在50岁以后略有升高。男性在睾丸衰退和克兰费尔特氏综合症的初期会出现体内促卵泡生成素(FSH)升高。另外，促卵泡生成素(FSH)的浓度在人体饥饿、肾衰竭、甲状腺机能亢进和肝硬化时也会有所提高。[0005] 在国内，促卵泡生成素(FSH)检测主要以国外进口试剂和免疫组化试剂。由于国外进口试剂和和免疫组化试剂的价格都非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，非常不利于在基层普及。国内具有自主知识产权的国产促卵泡生成素(FSH)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，并且仅停留在96孔微孔板式技术水平上，这种落后的检测技术的灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。
[0006] 因此，有待开发对促卵泡生成素(FSH)检测灵敏度高，可靠性强，并能够同时降低检测成本的检测技术。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种新的可定量检测促卵泡生成素(FSH)的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0009] 一方面，本发明提供了一种促卵泡生成素(FSH)定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。
[0010] 该试剂盒中各组分按照如下方法制备：
[0011] 一、校准品、质控品的配制方法如下：
[0012] 用校准品缓冲液溶解促卵泡生成素(FSH)，配置校准品和质控品；其中，所述校准
品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；
[0013] 二、抗试剂的制备方法如下：
[0014] (1)、抗试剂缓冲液的制备：
[0015] Tris：12.12mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；
[0016] (2)、异硫氰酸荧光素与促卵泡生成素(FSH)偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体：
[0017] 首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照促卵泡生成素(FSH)与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液，进行平衡，然后凝胶层析分离纯化出异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体；
[0018] (3)、碱性磷酸酶与促卵泡生成素(FSH)的偶联，获得碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体：
[0019] 首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液；然后按照碱性磷酸酶与促卵泡生成素(FSH)的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化出碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体，注意含有连接物的试管的避光防护；
[0020] (4)、将步骤(2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体和步骤(3)中获得的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体，加入到含有表面活性剂的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、Triton X-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的
添加量为0.01％～0.5％。
[0021] 本发明中，所述的异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成素(FSH)包被抗体和碱性磷酸酶标记的促卵泡生成素(FSH)标记抗体除能与促卵泡生成素(FSH)特异性结合外，配对使用时可与促卵泡生成素(FSH)形成“三明治”夹心结构。
[0022] 三、磁微粒试剂的制备：
[0023] 将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。
[0024] (1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2～5倍于反应瓶中羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20-30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；
[0025] (2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的质量比为100:1的比例，在在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，2～8℃下保持混匀状态反应18小时；[0026] (3)、反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲液清洗3遍，然后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。
[0027] 四、发光底物的制备
[0028] 将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物。
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