(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711462587.8
(22)申请日 2017.12.28
(71)申请人 重庆斯德姆生物技术有限公司
地址 400020 重庆市江北区港城东环路6号
6幢1-1
(72)发明人 熊华强 宋彩霞 孙静 秦连荣
熊惠芳
(74)专利代理机构 重庆百润洪知识产权代理有
限公司 50219
代理人 刘立春
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
A01N 1/02(2006.01)
(54)发明名称
方法
(57)摘要
本发明涉及一种脐带间充质干细胞培养上
清液的保藏方法，其包括如下步骤：取足月脐带，
鉴定符合要求后方可用；将脐带剪成组织段，剥
离华通胶，将华通胶剪成块状；采用双酶法消化
脐带组织块；过滤收集细胞，使用含有脐血血浆
的培养基培养与扩增间充质干细胞；采用饥饿培
养法，制备上清液；在上清液中加入保护剂进行
保藏。本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清
液的保藏方法确保在4℃存放15天后，干细胞上
清中的蛋白含量无明显变化，延长干细胞培养上
清液在4℃的存放时间，降低干细胞培养上清的
运输成本。权利要求书1页 说明书4页CN 108103014 A 2018.06.01
C N 108103014
A
1.一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV -RNA，抗-HDV，抗HEV，抗-HIV -1/2，HIV -1-RNA，CMV -DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；
(2)将脐带剪开，平铺，用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血；
(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段，然后剥离所述组织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，
用手术剪剪成块状；
(4)在步骤(3)获得的块状组织中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；
(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀，放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中，加入足量的含有脐血血浆的培养基，置于CO 2培养箱内培养；
(6)在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代；
(7)按6000cells/cm 2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培养瓶中，加入含有脐血血浆的培养基进行培养；
(8)待细胞长至80％融合时，使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多次，然后加入DMEM/F12培养基进行饥饿培养；
(9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中，离心，弃沉淀；
(10)收集步骤(9)获得的上清液，使用5KD的透析袋对干细胞上清进行浓缩，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；
(11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂，充分混匀后置于4℃保藏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述组织段的长度为2～4cm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述块状的表面积为1～2mm 3。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述消化为先加入0.1％II型胶原酶消化1小时，再加入0.25％胰酶消化0.5小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)所述饥饿培养时间为36-72小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上清液保护剂含有体积比10％的甘油或体积比10％的甘露醇。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上清液保护剂含有体积比5％的甘油和体积比5％的甘露醇。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有脐血血浆的培养基为含有体积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基。
权 利 要 求 书1/1页CN 108103014 A
一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞培养 上清液的保藏方法。
背景技术
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够进行自 我更新、多分化潜能的多能干细胞，可以向神经细胞、心肌细胞、肌 细胞等多种终末组织器官的细胞分化，其在细胞替代、支持造血、 基因等方面有着广泛的应用前景。
[0003]脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，有两条动脉和一条静脉。研 究显示，在脐带血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通胶)， 该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。从脐带分离出来的干细 胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大 降低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微 生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任 何危害及损伤。以上原因使得脐带间充质干细胞成为研究的热点。
[0004]目前已报道的脐带间充质干细胞分泌成分主要分为3类：1、细 胞外基质类，如各种胶原蛋白和弹性蛋白等，可促进细胞外基质的重 塑；2、生长因子类，如TGF、HGF、VEGF和bFGF等；3、炎症因
子及趋化因子类，如PGE2、IL-6、IL-8等。由于脐带间充质干细胞 能够分泌多种因子，因此，越来越多的研究集中在干细胞的旁分泌作 用，研究表明，干细胞旁分泌作用对皮肤损伤修复，参与机体的免疫 应答反应等方面具有重要的作用。
[0005]脐带间充质干细胞分泌的多种因子多为蛋白成分，如何确保干细 胞上清中有效因子的含量，是目前急需解决的问题，也是直接影响干 细胞临床应用的瓶颈之一，目前延长蛋白保存时间的唯一有效的方法 是降低保存温度，常用的是-20℃以下温度保存，这也给蛋白类物质 的运输增加了成本，本发明立足于延长脐带间充质干细胞培养上清液 冷藏时的存放时间，确保干细胞分泌因子的含量，为临床使用干细胞 分泌因子提供可能。
发明内容
[0006]为解决现有技术的不足，本发明提供了一种脐带间充质干细胞培 养上清液的保藏方法。
[0007]本发明第一方面提出一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏 方法，包括如下步骤：
[0008](1)取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的 方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗HEV， 抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带方 可使用；
[0009](2)将脐带剪开，平铺，用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血；
[0010](3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段，然后剥离所述组 织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，用手术剪剪成块状；
[0011](4)在步骤(3)获得的块状组织中，先后加入0.1％II型胶原 酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心， 去掉上清液；
[0012](5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀， 放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中，加入足量的含有脐血血浆的培养 基，置于CO2培养箱内培养；[0013](6)在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天 换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化 后传代；
[0014](7)按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于 培养瓶中，加入含有脐血血浆的培养基进行培养；
[0015](8)待细胞长至80％融合时，使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多 次，然后加入DMEM/ F12培养基进行饥饿培养；
[0016](9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心 管中，离心，弃沉淀；
[0017](10)收集步骤(9)获得的上清液，使用5KD的透析袋对干细 胞上清进行浓缩，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合 因子；以及
[0018](11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂，充 分混匀后置于4℃保藏。
[0019]根据本发明的一个实施例，步骤(3)所述组织段的长度为2～ 4cm。
[0020]根据本发明的一个实施例，步骤(3)所述块状的表面积为1～ 2mm3。
[0021]根据本发明的一个实施例，步骤(4)所述消化为先加入0.1％II 型胶原酶消化1小时，再加入0.25％胰酶消化0.5小时。
[0022]根据本发明的一个实施例，步骤(8)所述饥饿培养时间为36-72 小时。
[0023]根据本发明的一个实施例，所述上清液保护剂含有体积比10％ 的甘油或体积比10％的甘露醇。
[0024]根据本发明的又一实施例，所述上清液保护剂含有体积比5％的 甘油和体积比5％的甘露醇。
[0025]根据本发明的一个实施例，所述含有脐血血浆的培养基为含有体 积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基。
[0026]本发明具有以下有益效果：
[0027](1)本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法， 由于在冷藏时加入了上清液保护剂，显著延长干细胞培养上清液在 4℃存放的时间，降低干细胞培养上清液的运输成本，为临床应用干 细胞分泌因子提供可能。
[0028](2)根据本发明方法在4℃存放15天后，干细胞培养上清液中 的蛋白含量无明显变化，解决了低温冷藏时间长而导致蛋白含量下降 的问题。
[0029](3)本发明采用脐血血浆代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞， 避免了干细胞被病原体或其他动物源性成分污染及异种蛋白引起人 体免疫反应等不安全因素，且提高了培养过程中间充质干细胞的增值 速度。
[0030](4)相对于传统组织贴壁法，本发明采用双酶法制备间充质干 细胞，操作简单，耗时少。且本发明采用纤维连结蛋白包被的培养瓶 进行干细胞培养，有助于干细胞更好地贴壁生长。
具体实施方式
[0031]下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。
[0032]实施例
[0033]脐血血浆的制备：脐血供者的筛选、脐血采集、处理及检测依照 脐血库标准操作规程完成。在去除血浆的步骤中，无菌操作下留取5 mL上层血浆，置于4℃保存，经细菌、真菌、HBsAg、HBeAg、HCV、 HIV、CMV及梅毒等病原微生物检测为阴性后，方可用于实验。将 至少20份检测合格的脐血血浆等体积混合。4℃1200rpm离心10 分钟，用注射器小心抽取上清，以0.22μm滤膜过滤，分装，-20℃ 保存待用。
[0034]1、获取10cm剖腹产新生儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相 结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV， 抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴性 的脐带方可使用。
[0035]2、将脐带剪开，平铺，用3wt％氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS 缓冲液清洗脐带组织至无血。
[0036]3、将清洗后的脐带组织剪成长度为2～4cm的组织段，然后 剥离组织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，用手术剪剪成 1～2mm3的块状。
[0037]4、在剪碎的块状组织中，先加入0.1％II型胶原酶消化1小时， 再加入0.25％胰酶消化0.5小时，然后使用200目筛网过滤收集消化 后的细胞溶液，收集滤液，1200rmp离心10分钟，去掉上清液。
[0038]5、使用含有体积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基重悬步 骤(4)获得的细胞沉淀，放入纤维
连结蛋白包被的培养瓶中，加入 足量的含有体积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基，置于 5％CO237℃培养箱内培养。
[0039]6、在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天换 一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用0.25％胰蛋白酶37℃ 消化2分钟，加入4～5倍体积的培养基终止消化反应，然后1200rpm 离心10分钟，弃上清。沉淀用培养基重悬，以1:3比例传代。
[0040]7、按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培 养瓶中，加入含有体积比10％的脐血血浆的DMEM/F12培养基，置 于5％CO237℃培养箱内培养。
[0041]8、待细胞长至80％融合时，使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多2 次，吸尽PBS缓冲液，然后加入无脐血血浆的DMEM/F12培养基进 行饥饿培养72小时。
[0042]9、收集步骤8获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中， 1200rpm离心5分钟，弃沉淀。
[0043]10、收集离心后的上清液，使用5KD的透析袋对干细胞上清液 进行浓缩，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子。
[0044]11、在浓缩后的上清液中加入上清液保护剂(本实施例的上清液 保护剂分为三组：①体积比10％甘油、②体积比10％甘露醇、③体积 比5％甘油与5％甘露醇)，充分混匀后置于4℃冰箱保藏。
[0045]12、存放15天后用CCK-8测定各组干细胞上清液中蛋白的浓度。 结果如表1。[0046]对照例
[0047]以不添加上清保护剂的干细胞培养上清液作为对照。制备方法步 骤参考实施例
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