(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710923031.8
(22)申请日 2017.09.30
(71)申请人 广州万孚生物技术股份有限公司
地址 510663 广东省广州市萝岗区科学城
荔枝山路8号
(72)发明人 张秋平 陈立 李高辉
(74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 万志香
(51)Int.Cl.
G01N 33/569(2006.01)
G01N 33/531(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种用于检测尿液中HIV抗体
的样品垫、样品垫处理液及试纸条，所述样品垫
处理液包括pH为8～11的缓冲液、水性流变助剂
和封闭剂，其中，相对于每100mL的所述缓冲液，
所述水性流变助剂的添加量为0.05～10g，所述
封闭剂的添加量为0.05～10g。本发明的用于检
测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液通过
选择合适pH的缓冲液以及合适浓度的水性流变
助剂和封闭剂，可消除尿液对免疫金稳定性的影
响，提高免疫金的溶解释放速度及膜面层析形
态。权利要求书1页 说明书20页CN 107727855 A 2018.02.23
C N 107727855
A
1.一种用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述样品垫处理液包括pH为8～11的缓冲液、水性流变助剂和封闭剂，其中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述水性流变助剂的添加量为0.05～10g，所述封闭剂的添加量为0.05～10g。
2.根据权利要求1所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述缓冲液为10～200mM的Tris-HCL缓冲液。
3.根据权利要求1所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述样品垫处理液还包括0.01～1M的Na 2CO 3或K 2CO 3。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述样品垫处理液中还包括S9。
5.根据权利要求4所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，相对于每100mL的所述缓冲液，所述S9的添加量为0.01～1g。
6.根据权利要求1或2所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述水性流变助剂为羟丙基甲基纤维素、PAA、PEO中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述水性流变助剂为羟丙基甲基纤维素和PAA的混合物，所述羟丙基甲基纤维素占所述混合物总重量的45～70％。
8.根据权利要求1或2所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，其特征在于，所述封闭剂为兔血清。
9.一种样品垫，其特征在于，所述样品垫采用权利要求1～8任一项所述的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液进行处理。
10.一种检测尿液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，以及设置于底板上的如权利要求9所述的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜的两端分别搭接有样品垫和吸水纸，所述样品垫的近硝酸纤维素膜端喷涂有胶体金标记的HIV重组抗原和胶体金标记的鼠抗人IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被HIV重组抗原的检测线、以及包被羊抗鼠IgG抗体的控制线。
权 利 要 求 书1/1页CN 107727855 A
用于检测尿液中HIV抗体的样品垫、样品垫处理液及试纸条
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于检测尿液中HIV 抗体的样品垫、样品垫处理液及试纸条。
背景技术
[0002]人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的病毒，通过破坏人体免疫细胞，导致免疫系统失去抵抗力，而导致各种疾病。国家疾控中心统计，自2007年起，艾滋病成为中国造成死亡人数最高的传染病并延续至今。值得注意的是，目前中国仍有32.1％感染者未被发现。确定一个人是否感染艾滋病毒的唯一办法是进行艾滋病毒检测。数据显示， 2008-2015年间中国HIV检测量快速上升。据统计，仅2015年，全国约有超过1.43 亿人接受了HIV检测，占总人口的10％。
[0003]如此大规模的HIV检测对人力、物力、财力、时间都是一个严峻的挑战，特别是随着艾滋的全球蔓延、医护人员被感染的风险事例对HIV检测技术的开发和创新提出了“精准、快速、无创”的要求。
[0004]目前有关于艾滋诊断程序是初筛为阳性后再进行westernblot确诊。初筛的主要检测方法有两种：
[0005]1、血液检测：主要方法有免疫层析法(胶体金法或胶乳法)、化学发光法、时间分辨荧光法，即采集患者血样，用于体外定性或定量检测人血清、血浆和全血中的人类免疫缺陷病毒(HIV-1/HIV-2)抗体。这些方法主要是通过检测可疑者血液的HIV抗体的有无判断是否感染。
[0006]但是血液检测的方法是一种创伤性血液检测，而血液传播也是艾滋传播的3 大途径之一，其中，化学发光和时间分辨荧光需要大型设备，只有县级及以上的医院配备。其次，这2种方法耗时长，需要专门的操作人员和培训。三者的共同缺点是：
[0007]A、医护人员在抽血过程中被戳伤而感染的风险；
[0008]B、抽血后的各种医疗器械垃圾及处理(如：针头、针灸针、牙科器械、美容器械等)存在感染的风险；
[0009]C、采集的血样需要离心，难以进行患者自我检测从而保证患者的隐私。
[0010]2、口腔粘膜渗出液检测：主要方法有免疫层析法(胶体金法或胶乳法)。即用口腔拭子在牙龈线不断擦拭后的渗出液，检测人口腔粘膜渗出液中的 HIV-1/2型人类免疫缺陷病毒抗体。
[0011]该法是一种微创检测，相比血液传播的风险小很多，但仍存在传播的风险如艾滋接触人的高危人。
[0012]尿液中存在HIV特异性的抗体已经被大量研究和证实。无/极弱传染性的尿液检测方法CFDA批准的目前只有酶联免疫法，但耗时长(3h)，且只能定性检测。同样可进行定性检测的胶体金法由于其操作简便、耗时短而被亲睐和考虑的首选，但由于尿液抗体含量很低存在灵敏度的问题，故现有市场还未发现检测尿液中HIV抗体的试纸条的同类产品，此外，
有报道，尿液检测相比于血液，唾液存在较高的假阳性问题。
[0013]样品垫是检测尿液中HIV抗体的试纸条的一个重要组成部分，样品垫在使用前需要通过样品垫处理液进行处理。由于检测样本及项目的不同，使用现有的样品垫处理液应用于检测尿液中HIV抗体的试纸条时，均存在较大的问题，例如：HIV血液检测试纸条的样品垫处理液、HCV和HBV试纸条的样品垫处理液对于HIV阴性和阳性样本均无法实现显，而HIV唾液检测试纸条的样品垫处理液对于阴性和阳性样本显接近，故阴阳样本区分度很差。因此，有必要开发一种可用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液。
发明内容
[0014]一方面，基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液。
[0015]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0016]一种用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液，所述样品垫处理液包括pH为8～11的缓冲液、水性流变助剂和封闭剂，其中，相对于每100mL 的所述缓冲液，所述水性流变助剂的添加量为0.05～10g，所述封闭剂的添加量为0.05～10g。
[0017]发明人经大量的试验表明，缓冲液的pH为8～11时，可以消除假阳并保持强、中阳样本的检出，而当缓冲液的pH为酸性或中性时，则会出现金颗粒变、无法流动或假阳消除效果差的问题。水性流变助剂的加入可减慢尿液中水分子的流动，为金颗粒的反应提供一个液体环境，同时在喷涂的金颗粒的过程中提供一个支架，稳定地固定生物原材料不发生漂移均匀分布，保证了生物原材料分布的均一性。
[0018]在其中一些实施例中，所述缓冲液为10～200mM的Tris-HCL缓冲液。
[0019]在其中一些实施例中，所述样品垫处理液还包括0.01～1M的Na2CO3或 K2CO3。[0020]在其中一些实施例中，所述样品垫处理液中还包括S9。
[0021]在其中一些实施例中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述S9的添加量为0.01～1g。
[0022]在其中一些实施例中，所述水性流变助剂为羟丙基甲基纤维素、PAA、PEO 中的一种或几种。
[0023]在其中一些实施例中，所述水性流变助剂为羟丙基甲基纤维素和PAA的混合物，所述羟丙基甲基纤维素占所述混合物总重量的45～70％。
[0024]在其中一些实施例中，所述封闭剂为兔血清。
[0025]另一方面，本发明还提供了一种样品垫，所述样品垫采用上述用于检测尿液中HIV 抗体的试纸条的样品垫处理液进行处理。
[0026]再一方面，本发明还提供了一种检测尿液中HIV抗体的试纸条，所述试纸条包括底板，以及设置于底板上的上述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜的两端分别搭接有样品垫和吸水纸，所述样品垫的近硝酸纤维素膜端喷涂有胶体金标记的HIV重组抗原和胶体金标记的鼠抗人IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被HIV重组抗原的检测线、以及包被羊抗鼠IgG抗体的控制线。
[0027]在其中一些实施例中，所述胶体金标记的HIV重组抗原包括重组gp160；所述检测线上包被的HIV重组抗原包括重组gp41和gp160。
[0028]在其中一些实施例中，所述胶体金标记的HIV重组抗原还包括重组gp36，所述检测线上包被的HIV重组抗原还包括重组gp36。
[0029]在其中一些实施例中，所述胶体金标记重组gp160抗原的浓度为 1.5～3.5ug/ml；所述胶体金标记鼠抗人IgG的抗体的浓度为4.5～6.5ug/ml；所述胶体金标记重组gp36抗原的浓度为4.5～6.5ug/ml；胶体金标记原料的用量为 2～3.5ul/cm；所述HIV重组抗原gp41的包被浓度为0.5-2.0mg/ml，所述HIV重组抗原gp160的包被浓度为0.2-0.8mg/ml，所述HIV 重组抗原gp36的包被浓度为0.5-1.0mg/ml；所述HIV重组抗原的用量均为0.12-0.15ul/mm，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.8-1.0mg/ml，所述羊抗鼠IgG抗体的用量为0.09-0.22ul/ mm。
[0030]本发明还提供了一种检测尿液中HIV抗体的试纸条的制备方法，包括如下步骤：[0031]1)、配制样品垫处理液，涂布于玻璃纤维素膜上，涂布浓度为40ul/cm2，烘干处理制得样品垫；
[0032]2)、将检测HIV的抗体或抗原与胶体金颗粒结合形成胶体金标记检测HIV的抗体或抗原，用喷金仪均匀喷涂于样品垫上；晾干；
[0033]3)、将HIV重组抗原用HIV包被稀释液进行稀释至工作浓度，划线于硝酸纤维素膜上形成检测线，将羊抗鼠抗体稀释至工作浓度，划线于硝酸纤维素膜上形成质控线，烘干处理；
[0034]4)、将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接在底板上，即得。
[0035]为了解决尿液检测HIV的灵敏度和特异性的问题，本发明的发明人实施了多种研究，经确定运用固
相免疫层析原理，采用前期样品垫的敏感性处理及特异性抗原gp160、双抗夹心法间接法联用技术检测尿液中的HIV抗体，可以提高灵敏度和特异性。若尿液样品中含有HIV抗体，则HIV抗体与胶体金颗粒标记物结合，形成复合物，并扩散到硝酸纤维素膜上进一步层析，当遇到包被在硝酸纤维素膜上检测区(T线)处的配对抗原时，复合物则又和包被抗原结合，被捕获在包被处，当被捕获的复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的T线，说明样品中含有HIV抗体，若不出现，说明样品为阴性或含量低于试纸条的最低检测限。控制区(C线)作为试纸条的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。
[0036]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0037]1、本发明的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液通过选择合适pH的缓冲液以及合适浓度的水性流变助剂和封闭剂，可消除尿液对免疫金稳定性的影响，提高免疫金的溶解释放速度及膜面层析形态；
[0038]2、本发明的用于检测尿液中HIV抗体的试纸条的样品垫处理液通过进一步添加K2CO3/Na2CO3，可为反应提供一个更为稳定良好的碱性环境，与Tris-HCL缓冲液共同维持加入尿样后的碱性环境，从而消除假阳性的影响，并且提高了免疫金的溶解释放速度及膜面层析形态，即便pH偏酸性的尿液(pH＜7.0-7.5)金颗粒也能够有效释放，扩大了检测pH适用性；
[0039]3、尿液中抗体主要是IgG型，通过在试纸条中加入抗人IgG的抗体可以快速富集各类抗体，起到
一个浓缩作用，再通过HIV抗原的特异性从浓缩的富集的抗体中特异性结合HIV抗体，从而提高试纸条的灵敏度；
[0040]4、本发明的检测尿液中HIV抗体的试纸条降低了HIV接触者(如医务工作人员、婚
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