(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111196081.3
(22)申请日 2021.10.14
(71)申请人 华中科技大学同济医学院附属协和
医院
地址 430022 湖北省武汉市解放大道1277
号
(72)发明人 胡豫 梅恒 姚惟琦 石磊
董海波
(74)专利代理机构 武汉信合红谷知识产权代理
事务所(特殊普通合伙)
42264
代理人 严情
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及体外细
胞因子风暴模型及其构建方法和应用。体外细胞
因子风暴模型的构建体系，含有TNF ‑α因子、IL ‑
1β因子、IL ‑6因子和血管内皮细胞。上述体形成 的体外细胞因子风暴模型。体外细胞因子风暴模
型构建方法，将血管内皮细胞与TNF ‑α因子、IL ‑
1β因子、IL ‑6因子共同孵育。体外细胞因子风暴
模型在筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应
用。体外细胞因子风暴模型在制备筛选抗细胞因
子释放综合征药物中的应用。本发明的体外细胞
因子风暴模型通过TNF ‑α、IL ‑1β和IL ‑6三因子
联合处理血管内皮细胞得到，可制得细胞凋亡率
高、细胞活力亦明显下降的体外细胞因子风暴模
型，对多因子相关的炎症反应的研究提供了较好
的基础。权利要求书1页 说明书6页 附图6页CN 114032208 A 2022.02.11
C N 114032208
A
1.体外细胞因子风暴模型的构建体系，其特征在于，含有TNF ‑α因子、IL ‑1β因子、IL ‑6因子和血管内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的体外细胞因子风暴模型的构建体系，其特征在于，还具有培养基；所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
3.根据权利要求2所述的体外细胞因子风暴模型的构建体系，其特征在于，所述培养基为内皮细胞培养基。
4.体外细胞因子风暴模型构建方法，其特征在于，将血管内皮细胞与TNF ‑α因子、IL ‑1β因子、IL ‑6因子共同孵育。
5.根据权利要求4所述的体外细胞因子风暴模型构建方法，其特征在于，TNF ‑α因子、IL ‑1β因子、IL ‑6因子中任一浓度为100‑400ng/ml；孵育时长为24‑168h。
6.根据权利要求5所述的体外细胞因子风暴模型构建方法，其特征在于，TNF ‑α因子、IL ‑1β因子、IL ‑6因子中任一浓度为100‑200ng/ml；孵育时长为120‑168h。
7.根据权利要求4‑6任一所述的体外细胞因子风暴模型构建方法，其特征在于，TNF ‑α因子、IL ‑1β因子、IL ‑6因子三者浓度相同；孵育的温度为37℃；孵育的培养基为内皮细胞培养基。
8.体外细胞因子风暴模型，其特征在于，由权利要求1‑3任一所述体外细胞因子风暴模型的构建体系形成或由权利要求4‑6任一体外细胞因子风暴模型构建方法制备而得。
9.权利要求8中体外细胞因子风暴模型在制备筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应用。
10.权利要求8中体外细胞因子风暴模型在制备筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应用方法，其特征在于，用于筛选抗细胞因子风暴的物质。
权 利 要 求 书1/1页CN 114032208 A
体外细胞因子风暴模型及其构建方法和应用技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外细胞因子风暴模型及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome，CRS)，也被形象地称为细胞因子风暴(Cytokine Storm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子迅速大量的产生，如TNF ‑α、IL ‑1、IL ‑6、IL ‑12、IFN ‑α、IFN ‑β、IFN ‑γ、MCP ‑1和IL ‑8等，是一种严重危及生命的综合症状，标志着一种不受控制和功能失调的免疫反应，涉及淋巴细胞和巨噬细胞的持续激活和扩增，分泌大量的细胞因子，可能导致全身性炎症反应、多器官衰竭、高铁血红蛋白血症、急性呼吸窘迫综合征等疾病。除了细菌、病毒等微生物感染以外，进行CAR ‑T细胞也易出现细胞因子风暴，此外，进行免疫检查点抑制剂时也可能会出现细胞因子风暴，但概率极低。
[0003]现有技术中常用微生物感染动物，或者进行肿瘤杀伤后刺激巨噬细胞分泌(Liu Y ,et al ,.Gasdermin E –mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome.Sci Immunol.2020Jan 17；5(43):eaax7969.)来模拟细胞因子动物内源性风暴，这样的话细胞因子浓度不够确认，由于每次肿瘤细胞杀伤后的因子分泌浓度不稳定，所以动物体内也不稳定。
[0004]而体外细胞因子风暴模型的报道有：
[0005](1)娄振凯等(H 2O 2、LPS和TNF ‑α诱导人类脐静脉内皮细胞损伤的实验研究)的文章中分别采用不同浓度的过氧化氢(H 2O 2)、脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF ‑α)刺激人脐静脉内皮细胞，孵育不同时间，研究表明H 2O 2、LPS和TNF ‑α能体外损伤人类脐静脉内皮细胞，成功建立人类脐静脉内皮细胞损伤模型，且在一定浓度范围内各损伤因子对人类脐静脉内皮细胞损伤程度呈浓度和时间依赖性。
[0006](2)Speciale ,A等(Silibinin as potential tool against SARS ‑Cov ‑2:In silico spike receptor ‑binding domain and main protease molecular docking analysis ,and in vitro endothelial protective effects.Phytotherapy Research.2021；35:4616–4625.)探讨了水飞蓟属植物水飞蓟宾在体外对细胞因子(TNF ‑α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症和功能障碍的作用。
[0007](3)Chen ,Tielong等(Quercetin inhibits TNF ‑αinduced HUVECs apoptosis and inflammation via downregulating NF ‑kB and AP ‑1signaling pathway in vitro ,Medicine:September 18,2020‑Volume 99‑Issue 38‑p e22241)报道槲皮素通过下调NF ‑kB和AP ‑1信号通路抑制TNF ‑a诱导的HUVECs细胞凋亡和炎症反应。
[0008]由于本领域目前仅有使用单一因子在体外制备细胞因子风暴模型，如使用TNF ‑α，所得模型较为简单，并不能满足医药领域对于特定细胞因子诱导的炎症进行研究的模型需求，更没有多因子联合造模的报道，故急需一种制备多因子诱导的体外细胞因子风暴模型。
发明内容
[0009]针对上述问题，本发明提供体外细胞因子风暴模型及其构建方法和应用，解决了现有技术中体外细胞因子风暴的细胞模型通常是以单一细胞因子处理进行造模，且所得模型较为简单，难以满足医药领域日益变多的需求的缺陷，且模拟效果不是很好。
[0010]为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0011]体外细胞因子风暴模型的构建体系，含有TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子和血管内皮细胞。
[0012]一些方式中，还具有培养基；所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
[0013]一些方式中，所述培养基为内皮细胞培养基。
[0014]本发明提供的技术方案之二为：由上述体形成的体外细胞因子风暴模型。[0015]体外细胞因子风暴模型，由前述任一所述体外细胞因子风暴模型的构建体系形成。
[0016]本发明提供的技术方案之三为：由上述体外细胞因子风暴模型的制备方法。[0017]体外细胞因子风暴模型构建方法，将血管内皮细胞与TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子共同孵育。
[0018]一些方式中，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子中任一浓度为100‑400ng/ml；孵育时长为24‑168h。
[0019]一些方式中，更具体为，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子中任一浓度为100‑200ng/ml；孵育时长为120‑168h。
[0020]一些方式中，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子三者浓度相同；孵育的温度为37℃；孵育的培养基为内皮细胞培养基。
[0021]本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之二所述的体外细胞因子风暴模型在筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应用。
[0022]前述体外细胞因子风暴模型在制备筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应用。[0023]在本发明一具体实施方案中，所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC，HumanUmbilical Vein Endothelial Cell)。
[0024]本发明中，所述孵育的培养基可按本领域常规选择，一些方式中为内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM)。
[0025]在本发明一较佳实施方案中，所述方法在孵育结束后，还包括将制得的体外细胞因子风暴模型与
培养液分离的步骤，所述分离可为本领域常规的分离方法，例如换液。[0026]一些情况中，所述细胞因子释放综合征为由TNF‑α、IL‑1β和IL‑6引发的细胞因子释放综合征。
[0027]本发明第五方面涉及抗细胞因子释放综合征药物制备方法，具体包括下述步骤[0028]通过体外细胞因子风暴模型筛选对体外细胞因子风暴具有抑制作用的组分；将筛选所得有效组分用于制备抗细胞因子释放综合征药物。
[0029]前段将有效组分用于制药过程一种方式参考现有制药工艺。
[0030]本发明的有益效果是：
[0031]本发明所述的体外细胞因子风暴模型通过TNF‑α、IL‑1β和IL‑6三因子联合处理血管内皮细胞得到，可制得细胞凋亡率高、细胞活力亦明显下降的体外细胞因子风暴模型，对
多因子相关的炎症反应的研究提供了较好的基础。所述体外细胞因子风暴模型的细胞活力显著降低，满足体外研究药物效果更高的需求。
附图说明
[0032]图1为空白对照组处理24h、48h和72h的荧光拍照图；
[0033]图2为三因子处理组处理24h荧光拍照图；
[0034]图3为三因子处理组处理48h荧光拍照图；
[0035]图4为三因子处理组处理48h荧光拍照图；
[0036]图5为HUVEC细胞使用三因子(各100ng/ml)药物处理不同时间点的细胞凋亡率。[0037]图6为不同浓度三因子处理HUVEC细胞72h后的细胞活力；
[0038]图7为不同浓度三因子处理HUVEC细胞24h后的细胞活力；
[0039]图8为不同浓度三因子处理HUVEC细胞96h后的细胞活力；
[0040]图9为不同浓度三因子处理HUVEC细胞120h后的细胞活力；
[0041]图10为不同浓度三因子处理HUVEC细胞168h后的细胞活力。
具体实施方式
[0042]本部分第一方面对本发明方案进行说明：
[0043]体外细胞因子风暴模型的构建体系，含有TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子和血管内皮细胞。
[0044]该构建体系为风暴模型的组成制备体系，构建体系中的物质相互作用，通过该构建体系可以形成风暴模型。其中，构建体系为制备风暴模型过程中前期体系，主要为了表征制备风暴模型的物料组成。当然，其他具有与构建体系相同的方案，也应当等同落入本发明范围内。
[0045]一些方式中，构建体系还具有培养基；所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。[0046]一些方式中，所述培养基为内皮细胞培养基。
[0047]本发明提供的技术方案之二为：由上述体形成的体外细胞因子风暴模型。[0048]体外细胞因子风暴模型，由前述任一所述体外细胞因子风暴模型的构建体系形成。相对其他单因子或多因子模型，本发明的风暴模型具有更好的模拟效果。
[0049]本发明提供的技术方案之三为：由上述体外细胞因子风暴模型的制备方法。[0050]体外细胞因子风暴模型构建方法，将血管内皮细胞与TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子共同孵育。
[0051]一些方式中，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子中任一浓度为100‑400ng/ml；孵育时长为24‑168h。
[0052]一些方式中，更具体为，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子中任一浓度为100‑200ng/ml；孵育时长为120‑168h。
[0053]一些方式中，TNF‑α因子、IL‑1β因子、IL‑6因子三者浓度相同；孵育的温度为37℃；孵育的培养基为内皮细胞培养基。
[0054]本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之二所述的体外细胞因子风暴模型在筛选抗细胞因子释放综合征药物中的应用。
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