(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510713237.9
(22)申请日 2015.10.28
C12Q 1/68(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(71)申请人中国人民解放军第二军医大学
地址200433 上海市杨浦区翔殷路800号
(72)发明人崔淑芳 程继帅 肖邦 林丽芳
赵善民 汤球 孙伟 余琛琳
(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事
务所(普通合伙) 31268
代理人赵青
(54)发明名称
测试剂盒
(57)摘要
本发明涉及裸鼹鼠细胞因子IL-6基因检
测技术，属于生物技术检测领域。提供了一种
裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR 检测引物：正向
引物：5’-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3’，反向引物：
5’-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3’。还提供了一种裸
鼹鼠细胞因子IL-6基因的检测方法：提取裸鼹鼠
巨噬细胞细胞的总mRNA，并反转录为cDNA 作为检
测样品，运用Real-time PCR 方法进行检测，得出
IL-6的表达水平，利用PCR 检测技术定量和定性
的检测IL-6基因表达，简单快捷，适合推广使用。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书4页序列表2页 附图3页CN 105256038 A 2016.01.20
C N 105256038
A
1.一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测引物：
正向引物如SEQ ID NO:1所示，
反向引物如SEQ ID NO:2所示。
2.一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，其检测引物为：
正向引物：如SEQ ID NO:1所示，
反向引物：如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，还包括：
2×SYBR Premix Ex Taq 5ul，
50×ROX Reference Dye 0.2ul，
ddH
O 3.6ul。
2
4.根据权利要求2所述的裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，包括：
正向引物：如SEQ ID NO:1所示，
反向引物：如SEQ ID NO:2所示；
2×SYBR Premix Ex Taq 5ul；
50×ROX Reference Dye 0.2ul；
O 3.6ul。
ddH
2
5.一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：
提取裸鼹鼠巨噬细胞细胞的总mRNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用Real-time PCR方法进行检测，得出IL-6的表达水平，引物序列如下：
正向引物：如SEQ ID NO:1所示，
反向引物：如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求5所述的裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，其特征在于，具体检测步骤为：
A.提取mRNA：
分离培养裸鼹鼠巨噬细胞，提取细胞总RNA，并反转录为cDNA；
B.制备实时荧光定量PCR反应体系10ul：
取步骤A中cDNA模板0.8ul，2×SYBR Premix Ex Taq 5ul，10μΜ的PCR正向引物
O 3.6ul；设置阴0.2ul，10μΜ的PCR反向引物0.2ul，50×ROX Reference Dye0.2ul，ddH
2
性对照；
C.进行PCR反应：
反应循环设置为：保温阶段95℃30s循环阶段95℃5s，60℃34s，72℃30s，40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃1min，95℃15s，40个循环。
裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测引物及检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及裸鼹鼠细胞因子IL-6基因检测技术。
背景技术
[0002] 裸鼹鼠(Heterocephalus glaber，naked mole rat，NMR)是一种特别的啮齿类动物，其寿命是啮齿类动物中最长的，最老的个体超过3O岁，2O岁左右的动物身体状态普遍良好，超过25岁的裸鼹鼠表现虚弱的迹象，大都死于老年病；裸鼹鼠死于癌症的情况从未发现，解剖结果也从未发现肿瘤，具有一定的抗癌机制。裸鼹鼠抗肿瘤特性机制的探索将给肿瘤的研究翻开新的篇章。目前，很多的基础、临床和流行病学的研究已经证实，炎症是一个明确可以导致肿瘤的危险因素。病原学导致某种特定肿瘤发病的机制并不适用于其他癌种，但是本质上的发病机制都是相同的，就是炎症的诱导和维持。白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)(人IL-6的Gene ID:3569，小鼠IL-6的Gene ID:16193)能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。因此，对裸鼹鼠IL-6基因表达水平的检测有利于揭示其可能存在的抗肿瘤特性的机制。
[0003] 目前，由于裸鼹鼠性成熟晚(雌性性成熟年龄为228天，是小鼠的6.5倍；雄性性成熟年龄为12个月，是小鼠的8.1倍)、妊娠期长(68天，是小鼠的3.2倍)，且野生裸鼹鼠生活在炎热、干燥的东非地区，终生在黑暗的地下，难以捕捉。因此，裸鼹鼠的数目相对较少，极大地制约了它的应用研究。体外培养的细胞具有分裂和增殖能力，适应性强，易培养等特点，因此，体细胞培养技术可以解决裸鼹鼠研究材料来源较少的问题。
[0004] 目前，研究中对细胞因子IL-6基因表达的检测主要通过ELISA检测试剂盒进行，该方法中需要应用特异性抗体，然而目前尚没有针对裸鼹鼠的特异性抗体。
发明内容
[0005] 为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测的引物及检测试剂盒，利用PCR检测技术定量和定性的检测IL-6基因表达，简单快捷，适合推广使用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测引物：[0007] 正向引物：5’-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3’(SEQ ID NO:1)，
[0008] 反向引物：5’-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3’(SEQ ID NO:2)。
[0009] 本发明的第二方面，提供一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，其检测引物为：
[0010] 正向引物：如SEQ ID NO:1所示，
[0011] 反向引物：如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 上述裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，还包括：
[0013] 2×SYBR Premix Ex Taq 5ul，ROX Reference Dye(50×)0.2ul，ddH2O 3.6ul。
[0014] 较佳的，本发明所述的一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，包括：[0015] 正向引物：
如SEQ ID NO:1所示，
[0016] 反向引物：如SEQ ID NO:2所示；
[0017] 2×SYBR Premix Ex Taq 5ul；
[0018] ROX Reference Dye(50×)0.2ul；
[0019] ddH2O 3.6ul。
[0020] 本发明的第三方面，提供了一种裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，所述的检测方法利用上述特异性检测引物；或利用上述检测试剂盒，所述的检测方法包括如下步骤：
[0021] 提取裸鼹鼠巨噬细胞细胞的总mRNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用Real-time PCR方法进行检测，得出IL-6的表达水平，引物序列如下：
[0022] 正向引物：如SEQ ID NO:1所示，
[0023] 反向引物：如SEQ ID NO:2所示；
[0024] 上述裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，具体检测步骤为：
[0025] 1)提取mRNA：
[0026] 分离培养裸鼹鼠巨噬细胞，提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。
[0027] 2)制备实时荧光定量PCR反应体系10ul
[0028] 取步骤1)中cDNA模板0.8ul，2×SYBR Premix Ex Taq 5ul，PCR正向引物
O (10μΜ)0.2ul，PCR反向引物(10uM)0.2ul，ROX Reference Dye(50×)0.2ul，ddH
2 3.6ul。设置阴性对照。
[0029] 3)进行PCR反应
[0030] 反应循环设置为：保温阶段95℃30s循环阶段95℃5s，60℃34s，72℃30s，40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃1min，95℃15s，40个循环。
[0031] 本发明的技术效果如下：
[0032] 所用的引物针对裸鼹鼠IL-6的mRNA水平进行检测，提取裸鼹鼠巨噬细胞细胞的总mRNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用Real-time PCR方法进行检测，得出IL-6的表达水平，作为判断裸鼹鼠I
L-6基因表达发生改变的判断依据，具有良好的特异性和实用性。
附图说明：
[0033] 图1是实施例1实时荧光定量PCR检测的熔解曲线；
[0034] 图2是实施例1实时荧光定量PCR检测的扩增曲线；
[0035] 图3是实施例2中另外三对引物(b、c、d)和本发明中的引物序列(a)实时荧光定量PCR检测的熔解曲线。
具体实施方式
[0036] 具体结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但本发明的实施并不仅限于此。
[0037] 实施例1：
[0038] 根据GeneBank上裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的mRNA序列进行引物设计，引物序列如下：
[0039] 正向引物：5’-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3’(SEQ ID NO:1)
[0040] 反向引物：5’-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3’(SEQ ID NO:2)。
[0041] 具体检测步骤如下：
[0042] 1)提取mRNA：
[0043] 分离培养裸鼹鼠巨噬细胞，A组为空白对照组，标记为1、2；B组为实验组，使用病毒模拟物polyI:C刺激巨噬细胞，标记为3-6。分别提取细胞总RNA(TaKaRa RNAiso Plus)(Tang XL,Xin Y,et al.Metabolic Characteristics and Response to High Altitude in Phrynocephalus erythrurus(Lacertilia:Agamidae),a Lizard Dwell at Altitudes Higher Than Any Other Living Lizards in the World.PLoS One.2013Aug 7；8(8):e71976.)，并反转录为cDNA(FastQuant RT Kit(With gDNase)(KR106)，购自天根生化科技有限公司)。
[0044] 2)制备实时荧光定量PCR反应体系10ul
[0045] 取步骤1)中cDNA模板0.8ul，2×SYBR Premix Ex Taq 5ul，PCR正向引物(PCR Forward primer)(10μΜ)0.2ul，PCR反向引物(PCR reverse primer)(10uM)0.2ul，ROX Reference Dye(50×)0.2ul，重蒸水(ddH
O)3.6ul。设置阴性对照。
2
[0046] 3)进行PCR反应
[0047] 反应循环设置为：保温阶段(Holding stage)95℃30s；循环阶段(cycling stage)95℃5s，60℃34s，72℃30s，40个循环；溶解曲线阶段(Melt curve stage)95℃15s，60℃1min，95℃15s，40个循环。
[0048] 图1熔解曲线表示IL-6因子引物扩增的特异性(图中曲线1、2表示空白对照组，曲线3、4、5、6表示polyI:C刺激组)；图2扩增曲线表示空白对照组(1、2)和polyI:C刺激组(3、4、5、6)的实时荧光定量PCR扩增曲线。
[0049] 图1实施例1的熔解曲线图中，检测的所有样本PCR反应均出现单一的峰值，溶解温度Tm值为85.15℃，说明荧光定量PCR反应所用IL-6引物具有良好的特异性。图2扩增曲线中，纵坐标ΔRn指的是标准指示信号值减去基线信号值，横坐标表示循环数，从图中看出，检测的所有样品的ΔRn值均在PCR循环圈数完成之前进入平台期，说明实时荧光定量PCR反应结果有效。
[0050] 实施例2
[0051] 根据GeneBank上裸鼹鼠细胞因子IL-6基因的mRNA序列信息同时设计另外三种引物：
[0052] b：
[0053] 正向引物5’-CGTCAAGTAAGCCAACAA-3’(SEQ ID NO:3)，
[0054] 反向引物3’-GGAGGACTAGCGTAAACAG-5’(SEQ ID NO:4)。
[0055] c：
[0056] 正向引物：5’-TTACGCTAGTCCTCCACG-3’(SEQ ID NO:5)，
[0057] 反向引物：3’-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-5’(SEQ ID NO:2)。
[0058] d：
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