(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011226397.8
(22)申请日 2020.11.05
(71)申请人 四川大学华西医院
地址 610041 四川省成都市武侯区国学巷
37号
(72)发明人 庄伟华
(74)专利代理机构 成都正华专利代理事务所
(普通合伙) 51229
代理人 李蕊
(51)Int.Cl.
C07D 413/04(2006.01)
C09K 11/06(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种脂滴荧光探针及其合成
方法和应用，合成方法包括以下步骤：在惰性气
体保护下，9‑乙基‑3‑咔唑硼酸和4‑氯‑7‑硝基苯
并‑2‑氧杂‑1,3‑二唑在催化剂与添加剂的作用
下，在有机溶剂中于20～140℃条件下反应10～
100h，反应结束后，冷却至室温，加入二氯甲烷，
过滤，减压除去溶剂，分离纯化产物，干燥，即可。
本发明的应该探针在水溶液中没有荧光而在油
脂中具有很强的荧光，并可以特异性靶向到细胞
内的脂质，
适用于脂滴成像。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 112174946 A 2021.01.05
C N 112174946
A
1.一种脂滴荧光探针，其特征在于，结构如下式Ⅰ
所示：
2.权利要求1所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，
包括以下步骤：
在惰性气体保护下，9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑在催化剂与添加剂的作用下，在有机溶剂中于20～140℃条件下反应10～100h，反应结束后，冷却至室温，加入二氯甲烷，过滤，减压除去溶剂，分离纯化产物，干燥，即可。
3.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述催化剂为四(三苯基膦)钯、醋酸钯、氯化钯、二(乙腈)二氯化钯、二(苯腈)二氯化钯、二(三苯基膦)二氯化钯、双(二亚苄基丙酮)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、氯化烯丙基钯(II)二聚物、(1,5-环辛二烯)二氯化钯(II)、三氯化铑、醋酸铑、乙酰丙酮三苯基膦羰基铑、双环辛烯氯化铑二聚体、二氯(五甲基环戊二烯基)合铑(III)二聚体、三苯基膦氯化铑、三氯化钌、三苯基膦氯化钌、二氯二羰基双(三苯基膦)钌、双(2-甲基烯丙基)(1,5-环辛二烯)钌(II)中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N ,N -二甲基甲酰胺、N ,N -二甲基乙酰胺中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述添加剂为碳酸铯、醋酸铯、特戊酸铯、碳酸钠、醋酸钠、碳酸钾、焦磷酸钾、磷酸钠、醋酸钾、焦磷酸钠、碳酸氢钠中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为0.1～20:1。
7.根据权利要求6所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为0.5～5:1。
8.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，该反应在80～120℃下反应10～50h。
9.根据权利要求2所述的脂滴荧光探针的合成方法，其特征在于，所述惰性气体为氮气或氩气。
10.权利要求1所述的脂滴荧光探针在特异性标记脂滴方面的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112174946 A
一种脂滴荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种脂滴荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
[0002]脂滴是广泛存在于细菌、动物和植物细胞中，是细胞中性脂的主要储存场所。脂滴不仅在细胞能量平衡调节中起重要的作用，在信号传导和蛋白降解等细胞生理过程中也起着至关重要的作用。脂滴含量异常经常是一些疾病发生的信号。在动脉粥样硬化和脂肪肝等疾病的病灶中，脂滴的含量显著增大，其尺寸也明显增大。观察脂滴的大小和其形态变化对研究脂滴相关疾病具有重大的科学价值和临床价值。
[0003]荧光成像由于成像精度高和可实时成像等优点成为研究脂滴变化的首选。脂滴靶向型荧光探针成为研究脂滴的重要媒介。然而，目前商业化的脂滴荧光探针，如BODIPY 493/503和尼罗红，常受限于背景光强、光稳定性差和特异性需进一步提高等问题。信噪比更高、成像效果更好的脂滴特异性荧光探针的开发成为研究的重点。此外，目前取得商业化的脂滴荧光探针较少，且合成步骤繁琐，成本较高。开发新型高效的脂滴荧光探针具有潜在的应用价值。
发明内容
[0004]本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种脂滴荧光探针及其合成方法和应用。
[0005]本发明采用的技术方案如下：
[0006]一种脂滴荧光探针，结构如下式Ⅰ所示：
[0007]
[0008]上述的脂滴荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
[0009]
[0010]在惰性气体保护下，9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑在催化剂与添加剂的作用下，在有机溶剂中于20～140℃条件下反应10～100h，反应结束后，
冷却至室温，加入二氯甲烷，过滤，减压除去溶剂，分离纯化产物，干燥，即可。
[0011]本发明采用N-乙基咔唑作为供电基团，采用7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑作为吸电基团，制备具有推拉电子特征的D-A型荧光分子，所得荧光探针在固体和溶液状态中没有荧光，而在油里具有强烈的荧光，有效提高脂滴荧光成像的信噪比，实现细胞内脂滴的特异性荧光成像。
[0012]进一步地，催化剂为四(三苯基膦)钯、醋酸钯、氯化钯、二(乙腈)二氯化钯、二(苯腈)二氯化钯、二(三苯基膦)二氯化钯、双(二亚苄基丙酮)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、氯化烯丙基钯(II)二聚物、(1,5-环
辛二烯)二氯化钯(II)、三氯化铑、醋酸铑、乙酰丙酮三苯基膦羰基铑、双环辛烯氯化铑二聚体、二氯(五甲基环戊二烯基)合铑(III)二聚体、三苯基膦氯化铑、三氯化钌、三苯基膦氯化钌、二氯二羰基双(三苯基膦)钌、双(2-甲基烯丙基)(1,5-环辛二烯)钌(II)中的至少一种。
[0013]进一步地，有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、叔戊醇、1,4-二氧六环、1, 2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0014]进一步地，添加剂为碳酸铯、醋酸铯、特戊酸铯、碳酸钠、醋酸钠、碳酸钾、焦磷酸钾、磷酸钠、醋酸钾、焦磷酸钠、碳酸氢钠中的至少一种。
[0015]进一步地，9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为0.1～20:1。
[0016]进一步地，9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为0.5～5:1。
[0017]进一步地，9-乙基-3-咔唑硼酸和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为1:1。
[0018]进一步地，该反应在80～120℃下反应10～50h。
[0019]进一步地，该反应在110℃下反应24h。
[0020]进一步地，惰性气体为氮气或氩气。
[0021]上述的脂滴荧光探针在特异性标记脂滴方面的应用。
[0022]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0023]1、本发明通过用N-乙基咔唑作为供电基团，用7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑作为吸电基团，制备具有推拉电子特征的D-A型荧光分子，作为实现细胞内脂滴的特异性荧光成像的荧光探针；
[0024]2、本发明的荧光探针由于其特殊的D-A结构，在油脂中具有强烈的荧光，而在水溶液或有机溶剂中荧光很弱，有利于获得更好的信噪比，在泡沫细胞中能特异性标记脂滴；[0025]3、本发明制备方法简单，操作简便，原料易得，易实现工业化生产。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0027]图1为实施例1产物的核磁氢谱图；
[0028]图2为实施例1产物在油酸和水溶液中的荧光发射图；
[0029]图3为实施例1产物靶向细胞中油脂成像的激光共聚焦图。
具体实施方式
[0030]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。[0031]因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0032]需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0033]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0034]实施例1
[0035]本发明较佳的实施例提供一种脂滴荧光探针的合成方法，具体步骤如下：
[0036]
[0037]在氩气保护下，将9-乙基-3-咔唑硼酸(1.00g，4.18mmol)，4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(0.79g，3.97mmol)，四(三苯基膦)钯(0.24g，0.21mol)以及碳酸钠(1.33g，12.55mmol)加入250mL三口瓶中。加入经过超声脱气处理的甲苯(50mL)，乙醇(15mL)和水(5mL)，在氩气保护下于110℃条件下搅拌24小时。反应结束后冷却至室温，过滤并浓缩，用二氯甲烷溶解并过滤，进一步浓缩后通过快速柱层析分离出产物，得到0.95g红棕产物，产率为66.96％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.48-2.53(t,3H),4.40-4.50(m,2H),7.31-
7.37(d,1H),7.46-7.61(m,3H),7.80-7.85(d,1H),8.19-8.23(m,2H),8.58-8.63(d,1H),
8.89-8.94(d,1H)ppm.
[0038]实施例2
[0039]本发明较佳的实施例提供一种脂滴荧光探针的合成方法，具体步骤如下：
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