(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710545638.7
(22)申请日 2017.07.06
(71)申请人 南京大学
地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大
道163号
(72)发明人 张宴 乔如霞 任洪强
(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所
(普通合伙) 32204
代理人 肖明芳
(51)Int.Cl.
G01N 1/28(2006.01)
G01N 1/36(2006.01)
G01N 1/42(2006.01)
G01N 1/34(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一种制备棒状荧光标记微塑料
合液中进行荧光标记，然后缠绕在卷轴上来对齐
塑料纤维，覆冷冻包埋剂，冷冻后切割成小块并
排列成立方块，将立方块固定到组织切片机上连
续切片，最后切片用超纯水洗涤、烘干、称重既
得。通过本发明可以方便快捷地得到环境中普遍
存在的不同形状的荧光微塑料，便于定性、定量
分析不同形状的微塑料在环境介质中和生物体
内的分布和富集规律，并可广泛用于各类微塑料
的生态环境风险研究。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 107328622 A 2017.11.07
C N 107328622
A
1.一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)荧光标记：将染料储备液与正己烷混合制备混合液，把塑料纤维加入混合液中涡旋后静置1～2d，吸去混合液，用超纯水洗涤塑料纤维；
(2)对齐固定：将荧光标记后的塑料纤维缠绕在卷轴上来对齐纤维，纤维末端用胶带固定；
(3)冷冻包埋：将对齐的塑料纤维涂覆冷冻包埋剂，在-80～-40℃下冷冻成冻块，将冻块切割成平行的小块，并将小块排列成立方块，用锡纸包好；
(4)冷冻切片：将立方块固定到组织切片机上，以1～25μm的预设长度进行连续切片；
(5)洗涤离心：将切片用超纯水洗涤后离心，吸出水分后，烘干后称重即得。
2.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(1)所述染料储备液为染料以质量体积比2～5g/L溶于丙酮中制备的混合液，染料选自脂溶性染料；所述染料储备液与正己烷的混合体积比为1:2～1:4。
3.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(1)所述塑料纤维为聚苯乙烯塑料纤维、聚乙烯塑料纤维、聚酰胺塑料纤维、聚对苯二甲酸塑料纤维和聚丙烯塑料纤维中的一种或多种；塑料纤维的横断面直径为8～12微米。
4.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述卷轴的轴距为120～150mm；塑料纤维缠绕的匝数为10～15匝。
5.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(3)所述冷冻包埋剂为OCT包埋剂。
6.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(3)中切割的方向为垂直于塑料纤维长度方向，所述小块的切割尺寸为2～3cm；所述立方块由8～10片小块排列而成，使得包埋好的塑料纤维对齐平行。
7.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(4)中切片方向垂直于塑料纤维长度方向。
8.根据权利要求1所述的一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，其特征在于，步骤(5)所述烘干的温度为40～100℃。
9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的棒状荧光标记微塑料。
10.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的棒状荧光标记微塑料在研究微塑料在环境中或生物体内的富集分布的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 107328622 A
一种制备棒状荧光标记微塑料的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，制备的微塑料用于定性、定量分析不同形状的微塑料在环境介质和生物体内的分布和富集规律，可广泛用于各类微塑料的生态环境风险研究，属于高分子材料制备领域。
背景技术
[0002]微塑料是指直径小于5mm的塑料颗粒。由于塑料产量逐年增加且其本身难以降解，导致塑料污染已经成为海洋中的一大难题。紫外辐射和机械磨损可以将塑料降解成小尺寸的微塑料，微塑料的潜在环境健康风险越来越受到重视。文献研究发现，在实际环境和生物体检测中发现，微塑料的形状多种多样，
主要有纤维(棒状)，颗粒，片状，球形。来自渔网，绳索或衣服的塑料微纤维是水体中微塑料的普遍类型，其次是不规则形状的塑料碎片，颗粒和薄膜。受限于材料的获取，现阶段对微塑料的毒性研究主要针对球形，但是球形作为一个规则且非主要存在的微塑料不具代表性，因而有必要考察不同形状对微塑料在生物组织内富集分布和毒效应的影响。
[0003]材料的制备是不同形状微塑料研究的一项重要内容。目前普遍存在的制备材料的方法是，研磨，剪切，环境采样和从日常护理品中提取。这些方法所得的微塑料(1)粒径不均一，大小千差万别；(2)荧光强度弱，无法使用分子荧光光谱仪定量；(3)由于尺寸较大而不能被生物富集。且现有的方法费时费力，效率不高。
[0004]为了更好地研究微塑料在环境和生物体内的富集分布，评价微塑料的生态环境风险。本发明提供了一种快速制备不同形状的微塑料的方法，该方法所得到的微塑料相对均一，荧光强度较强，尺寸适合生物富集实验的需要，而且该方法可操作性强，效率高。
发明内容
[0005]发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，现阶段关于微塑料毒性研究中使用形状均一的塑料微球不能很好地模拟环境中不同形状的微塑料的现状，提供一种制备棒状荧光标记微塑料的方法，通过溶胀吸附法和冷冻切片法制备。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种棒状荧光标记微塑料的制备方法，包括如下步骤：
[0007](1)荧光标记：采用常规的溶胀吸附法，将染料储备液与正己烷混合制备混合液，把塑料纤维加入混合液中使用涡旋仪快速涡旋后静置1～2d，使用移液小心吸去混合液，并用超纯水反复洗涤塑料纤维3～5次。
[0008](2)对齐固定：将荧光标记后的塑料纤维缠绕在定制的卷轴上来对齐纤维，纤维末端用胶带固定。
[0009](3)冷冻包埋：将对齐的塑料纤维涂覆冷冻包埋剂，在-80～-40℃冰箱中冷冻成冻块，将冻块用刀片切割成平行的小块，并将小块排列成标准的立方块，用锡纸包好。[0010](4)冷冻切片：将立方块固定到组织切片机上，并使立方块对齐并垂直于刀片，手
摇切片机手轮以1～25μm的预设长度进行连续切片，将切片收集在玻璃烧杯中。
[0011](5)洗涤离心：将切片用超纯水洗涤3～5遍后离心，使用移液小心吸出水分后，在40～100℃下烘干1～2d后称重既得。
[0012]步骤(1)所述染料储备液为染料以质量体积比2～5g/L溶于丙酮中制备的混合液，染料选自脂溶性染料，优选尼罗红；所述染料储备液与正己烷的混合体积比为1:2～1:4。[0013]步骤(1)所述塑料纤维为聚苯乙烯塑料纤维、聚乙烯塑料纤维、聚酰胺塑料纤维、聚对苯二甲酸塑料纤维和聚丙烯塑料纤维中的
一种或多种，塑料纤维横断面直径为8～12微米。
[0014]步骤(2)所述定制的卷轴底台长220mm，宽80mm，高12mm，底台上部设有相距120～150mm，高50mm，直径为15mm的两根圆柱状轴；塑料纤维缠绕卷轴的匝数为10～15匝。[0015]步骤(3)所述冷冻包埋剂为OCT包埋剂。
[0016]步骤(3)中切割的方向为垂直于塑料纤维长度方向，所述小块的切割尺寸为长2～3cm的小块；所述立方块由8～10片小块排列而成，使得包埋好的塑料纤维对齐平行。[0017]步骤(4)中切片方向垂直于塑料纤维长度方向，从而将长纤维切割成数段短纤维。[0018]采用以上制备方法所制备得到的棒状荧光标记微塑料也在本发明的保护范围中。[0019]采用以上制备方法所制备得到的棒状荧光标记微塑料在研究微塑料在环境中和生物体内的富集分布的应用。
[0020]有益效果：
[0021]1、本申请所得到的微塑料荧光强度较强，且大小，形状相对均一，便于使用荧光显微镜和分子荧光光谱仪定性、定量分析不同形状的微塑料在环境介质和生物体内的分布和富集规律，可广泛用于各类微塑料的生态环境风险研究。
[0022]2、本申请采用的方法操作简单、方便、快捷，尤其与用剪刀手工剪切塑料纤维的繁重工作量相比更高效。
附图说明
[0023]下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0024]图1为本发明技术路线图。
[0025]图2为塑料荧光纤维对齐的定制卷轴。
[0026]图3为棒状荧光微塑料制备过程实物图。
[0027]图4为荧光显微镜下棒状荧光微塑料效果图。
[0028]图5为棒状荧光微塑料的粒径分布图。
[0029]图6为棒状荧光微塑料溶液在520nm下的激发光谱图。
[0030]图7为棒状荧光微塑料溶液的标准曲线图
[0031]图8为棒状荧光微塑料在斑马鱼组织内的含量图。
具体实施方式
[0032]下面结合具体实施事例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。以下实施例中，定制的卷轴底台长220mm，宽80mm，高12mm，底台上部设有相距130mm，高
50mm，直径为15mm的两根圆柱状轴；组织切片机型号为YD-202，产自金华市益迪医疗设备有限公司。尼罗红染料购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为N121291-250mg。冷冻包埋剂购自：美国樱花公司。
[0033]图1是本发明技术路线图。
[0034]实施例1
[0035]棒状聚苯乙烯荧光标记微塑料制备：
[0036](1)将尼罗红染料溶于丙酮，配置成2.5g/L的尼罗红染料储备液。用5mL的离心管将尼罗红染料储备液与正己烷以1:4的体积比混合。将未标记的聚苯乙烯纤维加入混合液中，涡旋后静置24h，使用移液小心吸去混合液，并用超纯水洗涤3次，得到荧光标记的聚苯乙烯纤维。
[0037](2)将荧光标记的聚苯乙烯纤维缠绕在定制的卷轴(如图2所示)上来对齐纤维，末端用胶带固定，如图3。
[0038](3)将对准的纤维涂覆冷冻包埋剂，在-80℃冰箱中冷冻26h，使纤维固定并变脆。用小刀将冻块切成2cm长的平行小块，并将其中8片小块整齐排列，制成标准的3.5cm×1cm ×2cm的立方体，用锡纸包好，确保所有纤维保持对准。
[0039](4)将排列的纤维立方块固定到组织切片机上，使得纤维对齐并垂直于刀片，设定25微米长度连续切片，并将切片收集在玻璃烧杯中；
[0040](5)用超纯水洗涤5遍后离心，用移液吸出水分后，55℃烘干称重，得到棒状荧光聚苯乙烯微塑料。如图4为荧光显微镜下棒状聚苯乙烯荧光标记微塑料效果图。
[0041]实施例2
[0042]棒状聚丙烯荧光标记微塑料制备：
[0043](1)将尼罗红染料溶于丙酮，配置成3g/L的尼罗红染料储备液。用5mL的离心管将尼罗红染料储备液与正己烷以1:3的体积比混合。将未标记的聚丙烯纤维加入混合液中，涡旋后静置36h，使用移液小心吸去混合液，并用超纯水洗涤4次，得到荧光标记的聚丙烯纤维。
[0044](2)将荧光标记的聚丙烯纤维缠绕在定制的卷轴(如图2所示)上来对齐纤维，末端用胶带固定。
[0045](3)将对准的纤维涂覆冷冻包埋剂，在-60℃冰箱中冷冻26h，使纤维固定并变脆。用小刀将冻块切成2cm长的平行小块，并将其中9片小块整齐排列，制成标准的3.5cm×1cm ×2cm的立方体，用锡纸包好，确保所有纤维保持对准。
[0046](4)将排列的纤维立方块固定到组织切片机上，使得纤维对齐并垂直于刀片，设定15微米长度连续切片，并将切片收集在玻璃烧杯中；
[0047](5)用超纯水洗涤5遍后离心，用移液吸出水分后，60℃烘干称重，得到棒状聚丙烯荧光标记微塑料。
[0048]实施例3
[0049]棒状聚乙烯荧光标记微塑料制备：
[0050](1)将尼罗红染料溶于丙酮，配置成5g/L的尼罗红染料储备液。用5mL的离心管将尼罗红染料储备液与正己烷以1:2的体积比混合。将未标记的聚乙烯纤维加入混合液中，涡旋后静置48h，使用移液小心吸去混合液，并用超纯水洗涤5次，得到荧光标记的聚乙烯纤
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